生物制藥工藝學總結

生物制藥工藝學第一章生物藥物概述1、我國藥物的三大藥源指的是化學藥物、生物藥物、中草藥.2、現(xiàn)代生物藥物已形成四大類型,包括基因工程藥物、基因藥物、天然生物藥物、醫(yī)學生物制品.藥物、生物藥物、生物制品藥物：用于預防、治療或診斷疾病或調節(jié)機體生理功能、促進機體康復保健的物質,有4大類：預防藥、治療藥、診斷藥和康復保健藥.生物藥物：是利用生物體、生物組織、細胞或其成分,綜合應用生物與醫(yī)學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的原理與方法進行加工、制造而成的一大類預防、診斷、治療和康復保健的制品.廣義：從動物、植物、微生物和海洋生物為原料等制取的各種天然生物活性物質以及人工合成或半合成的天然物質類似物；還包括生物工程技術制造生產(chǎn)的新生物技術藥物.醫(yī)學生物制品：一般指：用微生物包括細菌、噬菌體、立克次體、病毒等、微生物代謝產(chǎn)物、動物毒素、人或動物的血液或組織等加工制成的預防、治療和診斷特定傳染病或其它有關疾病的免疫制劑,主要指菌苗、疫苗、毒素、應變原與血液制品等.新生物制品審批辦法生物制品定義：是應用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和液體等生物材料制備的,用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品.生化藥物、微生物藥物生化藥物：指從生物體動物、植物、和微生物中獲得的天然存在的生化活性物質或者合成、半合成的天然物質類似物,其有效成分和化學本質多數(shù)比較清楚,通常按其化學本質和藥理作用分類命名.微生物藥物：是一類特異的天然有機化合物,包括微生物的初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物和微生物結構物質,還包括借助微生物轉化產(chǎn)生的藥物或中間體.基因重組藥物與基因藥物有什么區(qū)別基因重組藥物屬于基因工程藥物,這類藥物主要是應用基因工程和蛋白質工程技術制造的重組活性多肽、蛋白質及其修飾物.而基因藥物不是基因工程藥物,這類藥物是以基因物質RNA或DNA及其衍生物作為治療的物質基礎,包括基因治療用的重組目的DNA片段、重組疫苗、反義藥物和核酶等.生物藥物有哪些作用特點答：藥理學特性：1活性強:體內存在的天然活性物質2治療針對性強,基于生理生化機制3毒副作用一般較少,營養(yǎng)價值高4生理副作用常有發(fā)生,可能具免疫原性或產(chǎn)生過敏反應理化特性：1生物材料中有效成分濃度低,雜質種類多且含量相對較高2生物活性物質組成結構復雜、穩(wěn)定性差3生物材料易染菌、腐敗4生物藥物制劑的特殊要求：緩釋、控釋第二章生物制藥工藝技術基礎1、生化活性物質濃縮可采用的方法有鹽析濃縮、有機溶劑沉淀濃縮、用葡聚糖凝膠濃縮、用聚乙二醇透析濃縮、超濾濃縮、真空減壓濃縮與薄膜濃縮.2、生化活性物質常用的干燥方法有減壓干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等.3、冷凍干燥是在低溫、低壓條件下,利用水的升華性能而進行的一種干燥方法.4、固定化酶常采用的方法可分為吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價鍵結合法四大類.選擇題：5、由于目的蛋白質和雜蛋白分子量差別較大,擬根據(jù)分子量大小分離純化并獲得目的蛋白質,可采用CA、SDS凝膠電泳B、鹽析法C、凝膠過濾D、吸附層析6、分離純化早期,由于提取液中成分復雜,目的物濃度稀,因而易采用AA、分離量大分辨率低的方法B、分離量小分辨率低的方法C、分離量小分辨率高的方法D、各種方法都試驗一下,根據(jù)試驗結果確定簡述生物活性物質分離純化的主要原理.生物大分子分離純化的主要原理是：1根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離,如差速離心與超離心、膜分離、凝膠過濾等；2根據(jù)分子電離性質帶電性差異進行分離,如離子交換法、電泳法、等電聚焦法；3根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離,如溶劑提取法、鹽析法、等電點沉淀及有機溶劑分級沉淀等；4根據(jù)物質吸附性質的不同進行分離,如選擇性吸附與吸附層析等；5根據(jù)配體特異性進行分離,如親和層析法等.8、生化制藥的六個階段1原料的選擇和預處理2原料的粉碎3提?。簭脑现薪?jīng)溶劑分離有效成分,制成粗品的工藝過程.4純化：粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結晶等步驟進行精制的工藝過程.5濃縮、干燥及保存6制劑：原料藥精制品經(jīng)精細加工制成片劑、針劑、凍干劑、粉劑等供臨床應用的各種劑型.9、生物活性物質的來源及生物材料選擇的質量準則一生物活性物質的來源動物臟器血液、分泌物和其他代謝物海洋生物植物微生物開發(fā)生物新資源二生物原料選擇的質量準則：有效成分含量高的新鮮材料；來源豐富易得；成本比較低；雜質含量少原料的采集不破壞生態(tài)環(huán)境,對環(huán)境友好的原材料資源.10、常用的活性物質提取的方法有哪些①酸、堿、鹽水溶液提取方法②表面活性劑提取方法與反膠束提取方法③有機溶劑提?、茈p水相萃取法⑤超臨界萃取法11、鹽溶作用的原理在稀鹽溶液中,鹽離子作用于生物大分子表面,增加了表面電荷,使之極性增加,水合作用增強,促進形成穩(wěn)定的雙電層,對生物大分子起到助溶作用.12、活性物質提取時的保護性措施哪些活性物質的保護措施：1緩沖鹽系統(tǒng)：防止pH大幅度變化2保護劑：還原劑、酶的底物、金屬鰲合劑3抑制水解酶的作用加EDTA除去重金屬抑制酶活性選擇熱變性,使蛋白酶變性添加酶抑制劑4其它保護措施防過冷、過熱、酸、堿、紫外線、攪拌、高頻振蕩等13、生物制藥中分離制備方法的基本原理有哪些1據(jù)分子形狀和大?。翰钏匐x心與超離心、膜分離透析,電滲析與超濾,凝膠過濾法.2據(jù)分子電離性質的差異性：離子交換法,電泳法,等電聚集法.3據(jù)分子極性大小及溶解度不同：溶劑提取法,鹽析法,等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法.4據(jù)物質吸附性質的不同：選擇性吸附法與吸附層析法.5據(jù)配體特異性進行分離：親和層析法.第三章生物材料的預處理、細胞破碎和液-固分離1.細胞培養(yǎng)液的預處理方法.書P117-1201細胞及蛋白質的處理1加入凝聚劑2加入絮凝劑3變性作用4吸附5等電沉淀6加各種沉淀劑沉淀2.多糖的去除3.高價金屬離子的去除2.凝聚作用和絮凝作用的原理各是什么凝聚作用：指在某些電解質作用下,使膠體粒子的擴散雙電層的排斥電位降低,破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài),而使膠體粒子聚集的過程.絮凝作用：當往膠體懸浮液中加入絮凝劑時,膠?？蓮娏椅皆谛跄齽┍砻娴墓δ軋F上,而且一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上,形成架橋聯(lián)接,形成粗大的絮凝團沉淀出來,有助于過濾.3.常用的細胞破碎方法有哪些1機械法：勻漿法、珠磨法、超聲波2物理法：干燥、凍融、滲透壓沖擊3化學法：化學試劑處理、制成丙酮粉4生物法：酶解法、自溶4.固液分離方法有哪些1、細胞及蛋白質的處理1加入凝聚劑Al2SO43·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO32加入絮凝劑絮凝劑：有機高分子,易溶,鏈長,活性功能基團多影響因素：分子量、用量、pH、操作條件攪拌3變性作用4吸附加入吸附劑：活性碳除熱原加入反應劑：相互作用形成沉淀吸附蛋白質5加各種沉淀劑沉淀2過濾：常規(guī)和錯流3離心：過濾式離心和沉降式離心第四章萃取法1.掌握萃取與反萃取,分配系數(shù)與分配比,萃取比和萃取率,分離因素的概念.1萃?。毫弦号c萃取劑接觸后,料液中的溶質向萃取劑轉移的過程2反萃取：將萃取液與反萃取劑含無機酸或堿的水溶液或水相接觸,使某種被萃入有機相的溶質轉入水相的過程.3分配定律：一定溫度、一定壓力下,某一溶質在互不相溶的兩種溶劑間分配時,達到平衡后；在兩相中的活度之比為一常數(shù),如果是稀溶液,可以用濃度代替活度,即：K稱為分配系數(shù).4在萃取過程中,溶質在兩相的分子形式常常并不相同,仍然采用類似分配定律的公式作為基本公式.這時候溶質在萃取相和萃余相中的濃度,以分配比表示.分配比D：兩相中各種化學形式進行分配的溶質總濃度的比值K表示在特定的平衡條件下,被萃物在兩相中的有效濃度即分子形式一樣的比值；D表示實際平衡條件下被萃物在兩相中總濃度即不管分子以什么形式存在的比值.分配比隨著萃取條件變化而改變.5萃取因素：也稱萃取比,指被萃取溶質進入萃取相的總量與該溶質在萃余相中總量之比.通常以E表示.6萃取率：一種萃取劑對某種溶質的萃取能力工業(yè)上用7分離因素：料液中的溶質并非是單一的組分,除了所需產(chǎn)物A外,還存在有雜質B.分離因素常用表示,其定義為：在同一萃取體系內兩種溶質在同樣條件下分配系數(shù)的比值.值越大或越小分離效果越好,越接近于1,分離效果越差.2.萃取的方法有哪些萃取按照操作方式分類：一單級萃取二多級錯流萃取三多級逆流萃取方法：溶劑萃取、雙水相萃取、反膠團萃取、超臨界萃取3.影響溶劑萃取的因素1、乳化和破乳化2、pH的影響3、溫度和萃取時間的影響4、鹽析作用的影響5、溶劑種類、用量及萃取方式的選擇4.萃取的步驟有哪些1、混合2、液—液兩相分離3、離心萃取4、溶劑回收5.雙水相萃取、反膠束萃取、超臨界流體萃取基本原理及各自的優(yōu)點1雙水相萃取原理：利用生物物質在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進行分離的過程.優(yōu)點：保留產(chǎn)物的活性、可連續(xù)化操作2反膠束萃取：原理：表面活性劑溶于非極性溶劑中,并使其濃度超過臨界膠束濃度,便會在有機溶劑內形成聚集體,非極性基團在外,極性基團則排列在內,形成一個極性核,此極性核具有溶解極性物質的能力.當含有此種反膠束的有機溶劑與蛋白質的水溶液接觸后,蛋白質及其他親水性物質能夠溶于極性核內部的水中,由于周圍的水層和極性基團的保護,蛋白質不與有機溶劑接觸,從而不會造成失活.優(yōu)點：具有成本低、溶劑可反復使用、萃取率和反萃取率都高等.3超臨界流體萃取原理：利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質溶解能力來分離純化的技術.當氣體物質處于其臨界溫度Tc和臨界壓力Pc以上時,不會凝縮為液體,只是密度增大,具有許多特殊的物理化學性質：流體的密度接近于液體的密度,粘度接近于氣體；在臨界點附近,超臨界流體的溶解度對溫度和壓力的變化非常敏感；優(yōu)點:①具有廣泛的適應性：②萃取效率高,過程易于調節(jié)：③分離工藝流程簡單：④有些分離過程可在接近室溫下完成缺點：分離過程必須在高壓下進行,設備及工藝技術要求高,投資比較大,普及應用較為困難.6.什么是流體,利用CO2作為超臨界萃取的優(yōu)點流體是液體和氣體的總稱.流體是由大量的、不斷地作熱運動而且無固定平衡位置的分子構成的,它的基本特征是沒有一定的形狀和具有流動性.利用CO2作為萃取劑主要有以下優(yōu)點:1二氧化碳超臨界溫度Tc=℃是所有溶劑中最接近室溫的,可以在35～40℃的條件下進行提取,防止熱敏性物質的變質和揮發(fā)性物質的逸散.2在CO2氣體籠罩下進行萃取,萃取過程中不發(fā)生化學反應;又由于完全隔絕了空氣中的氧,因此,萃取物不會因氧化或化學變化而變質.3由于CO2無味、無臭、無毒、不可燃、價格便宜、純度高、容易獲得,使用相對安全.4CO2是較容易提純與分離的氣體,因此萃取物幾乎無溶劑殘留,也避免了溶劑對人體的毒害和對環(huán)境的污染.5CO2擴散系數(shù)大而粘度小,大大節(jié)省了萃取時間,萃取效率高.7、破乳方法主要有哪些1加表面活性劑：改變界面張力2離心：促進乳狀液滴碰撞聚集3電解質：中和電荷,鹽析蛋白質4加熱：促液滴布朗運動增加,降低黏度5吸附：介質對油和水的吸附能力差異破乳6高壓電：破壞雙電層等7稀釋：降低乳化劑濃度8其他：超濾、反應萃取、結合萃取劑和破乳劑的篩選第五章固相析出分離1.固相析出法主要包括鹽析法,有機溶劑沉淀法,等電點沉淀法,結晶法及其它多種沉淀方法等.2.按照一般的習慣,析出物為晶體時稱為結晶法,析出物為無定形固體則稱為沉淀法.3.KS鹽析法、β鹽析法右下圖示：鹽離子濃度與蛋白質溶解度關系曲線,在鹽析區(qū),符合公式logS=-KsS——蛋白質溶解度,g/L；—鹽離子強度；Ci——i離子濃度,mol/L；Zi——i離子化合價；——常數(shù),為縱坐標上的截距;Ks——鹽析常數(shù)兩種類型：1在一定的pH和溫度下改變離子強度鹽濃度進行鹽析,稱作Ks鹽析法.由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感,易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,因此常用于提取液的前處理.2在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析,稱作β鹽析法.由于溶質溶解度變化緩慢,且變化幅度小,因此分辨率更高,后期分離結晶.4.結晶包括三個過程：1形成飽和溶液；2晶核形成；3晶體生長.5.晶體的質量主要是指晶體的大小、形狀和純度等3個方面.選擇：1、在一定的pH和溫度下改變離子強度鹽濃度進行鹽析,稱作AA．KS鹽析法B．β鹽析法C．重復鹽析法D．分部鹽析法2、鹽析法與有機溶劑沉淀法比較,其優(yōu)點是BA.分辨率高B.變性作用小C.雜質易除D.沉淀易分離3、將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復合物,該復合物可選擇性地與蛋白質結合,在一定條件下沉淀出來,此方法稱為AA．親和沉淀B．聚合物沉淀C．金屬離子沉淀D．鹽析沉淀4、影響晶體大小的主要因素與下列哪些因素無關DA．過飽和度B．溫度C．攪拌速度D．飽和度思考題1.沉淀與結晶有何不同常用的沉淀方法包括哪些結晶是指溶質自動從過飽和溶液中析出,形成新相的過程.沉淀是溶液中難溶解的固體物質從溶液中析出的過程.結晶法：析出物為晶體.沉淀法：析出物為無定形固體.沉淀方法：1有機溶劑沉淀法2等電點沉淀3成鹽沉淀法4親和沉淀5高分子聚合物沉淀法6表面活性劑沉淀法2.何謂鹽析其原理是什么常用的鹽析方法有哪些影響鹽析的主要因素有哪些鹽析操作時常用的鹽是什么1鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異,通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽,使目的物或雜蛋白以沉淀析出,達到純化目的的方法.2原理：鹽溶現(xiàn)象和鹽析作用鹽析作用的原理是：破壞雙電層：在高鹽溶液中,帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質表面的電荷,使蛋白質分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來.破壞水化層：中性鹽的親水性比蛋白質大,鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質脫去了水化膜,暴露出疏水區(qū)域,由于疏水區(qū)域的相互作用,使其沉淀.3影響鹽析的因素①無機鹽的種類鹽析用鹽的選擇：鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟②溶質蛋白質等種類：Ks、β③溶質蛋白質等濃度：2~3%④溫度⑤pH4鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉.硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑3.有機溶劑沉淀法的主要原理是什么影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些1主要原理：①親水性有機溶劑加入溶液后降低了介質的介電常數(shù),使溶質分子之間的靜電引力增加,聚集形成沉淀.②水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度,壓縮了親水溶質分子表面原有水化層的厚度,降低了它的親水性,導致脫水凝集.以上兩種因素相比較,脫水作用比靜電作用強.2影響沉淀效果的因素①有機溶劑種類②pH的影響③溫度④無機鹽的含量⑤某些金屬離子的助沉淀作用⑥樣品濃度4.什么是結晶結晶過程包括哪些在何種條件下,溶液中才有晶體析出1溶液中的溶質在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結合成晶體.結晶是指溶質自動從過飽和溶液中析出,形成新相的過程.2過程：①形成過飽和溶液；②晶核形成；③晶體生長3溶質只有在過飽和溶液中才能析出條件：推動力：形成新相固體需要一定的表面自由能.因此,溶液濃度達到飽和溶解度時,晶體尚不能析出,只有當溶質濃度超過飽和溶解度后,才可能有晶體析出.晶核：最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心,稱為晶核.首先形成晶核,由Kelvin公式,微小的晶核具有較大的溶解度.實質上,在飽和溶液中,晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中,只有達到一定的過飽和度以后,晶核才能夠穩(wěn)定存在.5.提高晶體質量的途徑晶體質量包括三個方面的內容：晶體大小、形狀和純度1晶體大小1過飽和度過飽和度值應大至使結晶操作控制在亞穩(wěn)區(qū)內,又保持較高的晶體生長速率,使結晶高產(chǎn)而優(yōu)質.2溫度緩慢冷卻3攪拌速度：適當,不宜太快4晶種：誘導結晶,控制晶體形狀大小均勻度2晶體形狀控制晶體生長速度和結晶溫度控制過飽和度選擇不同的溶劑調節(jié)溶液的pH有目的地加入某種能改變晶形的雜質3晶體純度雜質對晶體的成長速率的影響較為復雜,有的雜質能抑制晶體的成長,有的能促進成長,有的能改變晶型.過濾分離母液中的雜質晶體越細小,雜質越多洗滌有利提高純度結晶速度過快,易產(chǎn)生“晶蔟”,包含雜質4晶體結塊原因：粒度不齊、空氣濕度高、溫度高、受壓、貯存時間增長措施：控制粒度分布、良好外形、干燥密閉容器貯存重結晶：晶體用合適溶劑溶解后再次結晶,提高純度第六章吸附分離法1、吸附劑按其化學結構可分為兩大類：一類是有機吸附劑,如活性炭、淀粉、大孔吸附樹脂等；另一類是無機吸附劑,如白陶土、氧化鋁、硅膠、硅藻土等.2、常用的吸附劑有活性炭、硅膠和白陶土等.3、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑按骨架的極性強弱,可分為非極性、中等極性、極性和強極性吸附劑四類.選擇：1、用大網(wǎng)格高聚物吸附劑吸附的弱酸性物質,一般用下列哪種溶液洗脫DA.水B.高鹽C.低pHD.高pH2、“類似物容易吸附類似物”的原則,一般極性吸附劑適宜于從何種溶劑中吸附極性物質BA.極性溶劑B.非極性溶劑C.水D.溶劑3、活性炭在下列哪種溶劑中吸附能力最強AA.水B.甲醇C.乙醇D.三氯甲烷4、關于大孔樹脂洗脫條件的說法,錯誤的是：AA.最常用的是以高級醇、酮或其水溶液解吸.B.對弱酸性物質可用堿來解吸.C.對弱堿性物質可用酸來解吸.D.如吸附系在高濃度鹽類溶液中進行時,則常常僅用水洗就能解吸下來.問答：1、吸附原理吸附作用：界面上的分子同時受到不相等的兩相分子的作用力,界面分子的力場不飽和,即存在一種固體的表面力,能從外界吸附分子、原子或離子,并在吸附劑表面附近形成多分子層或單分子層.2、大網(wǎng)格吸附劑及其吸附的特點大孔網(wǎng)狀吸附劑大網(wǎng)格吸附劑：在樹脂聚合時加入惰性的致孔劑,待網(wǎng)格骨架固化和鏈結構單元形成后,用溶劑萃取或蒸餾水洗將致孔劑去掉,形成不受外界環(huán)境條件影響的孔隙,其孔徑遠大于2～4nm,可達100nm,故稱“大孔”.特點：①選擇性好、解吸容易、理化性質穩(wěn)定、機械強度好、可反復使用等優(yōu)點.②其孔隙大小、骨架結構和極性,可按照需要,根據(jù)不同的原料和合成條件而改變,因此可③適用于吸附各種有機化合物.④適合弱電解質及非離子型化合物分離.3、大網(wǎng)格吸附劑吸附的操作過程⑴樹脂選擇⑵吸附條件選擇⑶洗脫條件選擇預處理、上樣、吸附、洗雜、洗脫、再生第七章凝膠層析1、葡聚糖凝膠的孔徑大小取決于交聯(lián)度,其越小,凝膠孔徑越大；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴于瓊脂糖濃度.2、瓊脂糖凝膠的一個特征是分離的分子量范圍非常大,其分離范圍隨著凝膠濃度上升而下降,顆粒強度隨濃度上升而提高.選擇：1、凝膠層析中,有時溶質的Kd>1,其原因是BA.凝膠排斥B.凝膠吸附C.柱床過長D.流速過低2、凝膠層析中,有時小分子溶質的Kd<1,其原因是AA.水合作用B.凝膠吸附C.柱床過長D.流速過低3、在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是AA.分子量最大的B.體積最大的C.分子量最小的D.體積最小的4、為了進一步檢查凝膠柱的質量,通常用一種大分子的有色物質溶液過柱,常見的檢查物質為藍色葡聚糖,下面不屬于它的作用的是CA.觀察柱床有無溝流B.觀察色帶是否平整C.測量流速D.測量層析柱的外水體積思考題1.凝膠層析的原理及特點.凝膠層析原理：是將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠固定相,由于各組分流經(jīng)體積的差異,使不同分子量的組分得以分離的層析方法.特點：1凝膠層析操作簡便、設備簡單僅需一根層析柱.2分離效果較好,重復性高,樣品回收率高,接近100%.3分離條件緩和.4應用廣泛.5分辨率不高,分離操作較慢.2.柱床體積、內水體積、外水體積、基質體積、洗脫體積、分配系數(shù)、全滲入、全排阻⑴柱體積VA：柱體積是指凝膠裝柱后,從柱的底板到凝膠沉積表面的體積,又稱“床”體積VA.⑵外水體積Vo：色譜柱內凝膠顆粒間隙,這部分體積稱外水體積,亦稱間隙體積,常用V0表示.⑶內水體積Vi：因凝膠為三維網(wǎng)狀結構,顆粒內部仍有空間,液體可進入顆粒內部,水的總和為內水體積,又稱定相體積,常用表示.不包括基質的體積Vg.VA=V0+Vi+VgV柱內空間＝Vo＋Vi柱床體積VA可以通過加入一定量的水至層析柱預定標記處,然后測量水的體積來測定.VA=1/4D2h計算外水體積Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質的洗脫體積來測定,一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質.因為它的分子量大為200萬,在各種型號的凝膠中都被排阻,并且它呈藍色,易于觀察和檢測.⑷峰洗脫體積淋出體積Ve：是指被分離物質通過凝膠柱所需洗脫液的體積,常用Ve表示.Ve=V0+Vi,aceVi,ace是Vi的一部分,它與Vi之比成為Kd分配系數(shù)Ve=V0+ViKd5排阻系數(shù)分配系數(shù)Kd當Kd=1時,洗脫體積Ve=V0+Vi,為全滲入.當Kd=0時,洗脫體積Ve=V0,為全排阻.0＜Kd＜1時,洗脫體積Ve=Vo+KdVi,為部分滲入.因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定了物質流出的順序.3.了解葡聚糖凝膠、生物凝膠、瓊脂糖凝膠的結構及特點⑴葡聚糖凝膠Sephadex①結構商品名為SephadexG類.交聯(lián)葡聚糖的基本骨架是葡聚糖.再經(jīng)3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑,形成三維網(wǎng)狀結構的高分子化合物.其交聯(lián)度是通過交聯(lián)劑的加量及反應條件來控制的.②性質：穩(wěn)定性.存在非特異性吸附⑵聚丙烯酰胺凝膠生物凝膠①結構：商品名為生物凝膠-PBio-GelP.該凝膠由丙烯酰胺組成；以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,聚合而成.②聚丙烯酰胺凝膠的性質：1孔徑大小可通過交聯(lián)度調整；2穩(wěn)定性、強度；3無非特異吸附,保存方便；4生物凝膠的編號反映出它的分離界限.如Bio-GelP-100.⑶瓊脂糖凝膠①結構：是由β-D-半乳糖與3,6-脫水-L-半乳糖以α-1,3-和β-1,4-糖苷鍵相間連接而成的鏈狀分子.②特點Α、沒有共價鍵的交聯(lián).Β、孔徑瓊脂糖的濃度.C、瓊脂糖凝膠的化學穩(wěn)定性較差.D、顆粒強度差.E、非特異性吸附力低.F、分離范圍大.4.什么是“類分離”和“分級分離”1.將分子量極為懸殊的兩類物質分開,如蛋白質與鹽類,稱作類分離.2.將分子量相差不大的大分子物質加以分離,如分離血清球蛋白與白蛋白,這叫做分級分離.5.在實驗中應如何選擇凝膠與預處理1凝膠的選擇：一方面要考慮凝膠的性質,包括凝膠的分離分子量范圍滲入限和排阻限,理化穩(wěn)定性,強度、非特異性吸附性質等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質.①選擇作類分離的凝膠是,應使樣品中大分子的分配系數(shù)Kd=0,小分子的Kd=1.②選擇作分級分離的凝膠型號時必須使各種物質的Kd值盡可能相差大.要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側,或接近兩側的位置.如果樣品中含有3個組分,最好一個接近全排阻,另一個接近全滲入,第三個為部分滲入,且分子量大于滲入限的3倍,并小于排阻限的1/3.2凝膠粒度的選擇：細粒凝膠柱流速低,洗脫峰窄,分辨率高,用于精制分離或分析.粗粒凝膠柱流速高,洗脫峰平坦,分辨率低,用于粗制分離,脫鹽.此外,凝膠顆粒必須均勻,顆粒越小更好.3預處理：凝膠在使用前須溶漲,使干膠顆粒充分吸收溶劑,并達到平衡.干膠以10倍以上吸液量的溶劑浸泡.熱法溶漲水浴.6.凝膠用過后,有那幾種保存方法葡聚糖凝膠有3種,干法、濕法和半縮法1濕法：加入一定量的防腐劑置于冰箱中作短期保存.2干法：用濃度逐漸升高的乙醇分步處理洗凈的凝膠,脫水收縮,抽濾,用60~80℃吹干3半縮法：60-70%乙醇使凝膠部分脫水收縮,封口,4℃保存瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥,否則不能再溶脹恢復原有形狀,因此商品在都以含水狀態(tài)供應,并應在濕態(tài)保存.一般懸浮在103mol/LEDTA和%疊氮化鈉溶液中.避免硼酸緩沖液7.凝膠層析的操作步驟1樣品和加樣蛋白質類樣品濃度:不大于4%.樣品粘度小于；樣品渾濁應先過濾除顆粒后上柱2洗脫與收集1.洗脫劑：常采用緩沖鹽溶液進行洗脫；洗脫液的成分也不應改變,以防凝膠漲縮引起柱床體積變化或流速改變.流速操作壓、型號、粒度.整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓；編號小,顆粒粗---流速大；與操作壓成正比,柱長成反比.部分收集器.3凝膠柱的再生板結、不溶物污染、嚴重吸附；反沖.重新裝柱.8.細粒凝膠柱流速慢,洗脫峰越窄,分辨率高,適用于什么產(chǎn)品的分離或分析粗粒凝膠柱流速高,但洗脫峰平坦,分辨率低,適用于產(chǎn)品制備那個階段的分離1用于精制分離或分析2用于粗制分離,脫鹽9.凝膠層析的應用范圍有哪幾方面⑴脫鹽和濃縮⑵分子量測定⑶凝膠在生化制藥中的應用包括：去熱原和分離純化10.在凝膠層析中要想得到好的層析結果應注意哪些問題和采取那些措施注意有沒有色譜峰變寬.措施：減少峰寬效應,選擇合適溶劑,填料均勻,填料粒度一致,降低流速,適當增加柱長,增加分辨率里兩個峰的峰間距離.凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題:1流速慢1有氣泡、出水管阻塞2沒打開夾子3柱壓太緊操作壓過大、長期使用2柱內產(chǎn)生氣泡1上水口不流或皮管破裂,洗脫液外流2接口漏氣,如上水口螺絲擰的不緊3條帶扭曲1膠面不平2樣品或洗脫液中有顆粒3裝柱不均勻4分辯率不高1裝拄不均勻2樣品量過大3流速太快4柱不垂直或柱不合適5長菌6柱下口軟管太長7膠不適當11.根據(jù)凝膠層析分離大分子物質的原理,分子質量為2萬,6萬和10萬的蛋白質可選擇哪種規(guī)格型號的SephadexG凝膠將三者分開洗脫后順序如何為什么選擇：SephadexG-75洗脫順序是10萬＞6萬＞2萬因為分子量較小的分子可以占據(jù)較多的孔體積,而大分子占有的孔體積較小,小分子在柱中停留時間比大分子長,于是樣品各組分按分子大小順序而分開,最先洗脫出來的是最大的分子.若要脫鹽的就選擇SephadexG-25第八章離子交換法1、離子交換劑由載體、功能基團和平衡離子組成.平衡離子帶正電荷為陽離子交換樹脂,平衡離子帶負電荷稱陰離子交換樹脂.2、寫出下列離子交換劑類型：732強酸001x7樹脂強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂,724弱酸101x4樹脂陽離子型,717強堿201x7樹脂強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂,CM-C羧甲基纖維素弱酸性陽離子交換纖維素,DEAE-C二乙基氨基乙基纖維素強堿型陰離子交換纖維素,PBE94多緩沖交換劑堿性陰離子交換劑.3、色譜聚焦chromatofocusing是一種高分辨的新型的蛋白質純化技術.它是根據(jù)蛋白質的等電點,結合離子交換技術的大容量色譜,能分離幾百毫克蛋白質樣品,洗脫峰被聚焦效應濃縮,分辨率很高,操作簡單.4、在采用多緩沖陰離子交換劑作固定相的離子交換聚焦色譜過程中,當柱中某位點之pH值下降到蛋白質組分PI值以下時,它因帶正電荷而下移,如果柱中有兩種蛋白組分,pI值較大者會超過另一組分,移動至柱下部pH較高的位點進行聚焦.思考題：1.離子交換層析的原理利用溶液中帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離.2.離子交換樹脂的分類分類：平衡離子帶正電荷：陽離子交換樹脂平衡離子帶負電荷：陰離子交換樹脂具體分為：陽離子交換樹脂分類：強酸型樹脂、中酸性樹脂、弱酸性樹脂陰離子交換樹脂分類：強堿型陰離子交換樹脂、弱堿型陰離子交換樹脂、中強堿性陰離子交換樹脂3、離子交換樹脂的預處理和再生辦法樹脂的預處理1物理處理：去雜,過篩.2化學處理：用8～10倍的1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液交替浸泡.3最后以去離子水或緩沖夜平衡再生過程：1去雜,大量水沖洗,除去物理吸附的雜質.2用酸、堿處理除去與功能基團結合的雜質.3轉型：按要求的人為的賦予平衡離子的過程4、多糖基離子交換劑主要分為哪兩類離子交換纖維素葡聚糖凝膠離子交換劑5、CM-sephadexC-25羧甲基纖維素；C—陽離子功能基團是：羧甲基；載體是：葡聚糖凝膠；型號是：G-25；類型：弱酸型陽離子交換劑DEAE-sephadexA-25二乙胺基乙基纖維素；A—陰離子功能基團是：二乙基氨基乙基纖維素；載體是：葡聚糖凝膠；型號：G-25；類型：強堿型陰離子交換劑7、離子交換法有哪些方面的應用分離純化——氨基酸制備無鹽水制備8、色譜聚焦的原理自動形成pH梯度.蛋白質的色譜行為聚焦效應9、K值為離子交換常數(shù),K＞1說明樹脂對交換離子吸引力較大10、由下圖,利用給出的兩種離子交換劑E1,E2分離3種蛋白質P1、P2、P3,用箭頭流程圖表示并指出E1,E2的類型.E1弱酸型陽離子交換劑E2為強堿陰離子交換劑11、請以CM-C為例說明離子交換纖維素分離純化蛋白質時的洗脫方法有哪些并說出各種方法的洗脫原理.升高環(huán)境的pH、降低pH或是增加離子強度都能將被吸附物質洗脫下來.H2N-P表示蛋白質C表示離子纖維素第九章親和純化技術1、親和層析洗脫方法有非專一性洗脫,特殊洗脫,專一性洗脫.2、親和力大小除由親和對本身的解離常數(shù)親和勢KL決定外,還受許多因素的影響,其中包括微環(huán)境、空間位阻、配基濃度、載體孔徑、結合位點等.3、親和層析中常用作分離酶的配基有底物的類似物,抑制劑,輔酶和底物.4、親和層析中非專一性吸附有離子效應、疏水作用、復合親和力.5、親和過濾指的是將親和層析和膜過濾結合運用,它包括親和錯流過濾和親和膜分離兩大方法.選擇題：1、制備親和柱時,應首先選用的配基是AA.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不確定2、親和層析的洗脫過程中,在流動相中加入配基的洗脫方法稱作CA.陰性洗脫B.劇烈洗脫C.競爭洗脫D.非競爭洗脫3、親和層析的洗脫過程中,在流動相中減去配基的洗脫方法稱作DA.陰性洗脫B.劇烈洗脫C.正洗脫D.負洗脫三、名詞解釋1、親和反膠團萃取指在反膠團相中除通常的表面活性劑以外,添加另一種親水頭部為親和配基的助表面活性劑；通過親和配基與目標分子的親和結合作用,促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配.2、親和膜：親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質,是固定床親和層析的變型.3、二次作用親和沉淀親和介質結合目標分子后,通過改變物理場使介質與目標分子共同沉淀的方法稱為二次作用親和沉淀.4、親和萃?。豪门悸?lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取,在親和配基的親和結合作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相上相的分配,提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性.5、親和吸附劑：被固定在基質上的分子稱為配體,配體和基質是共價結合的,構成親和層析的固定相,稱為親和吸附劑.6、負洗脫：S固定化配基,E酶,I游離配基也叫反競爭性效應：ESI>EI穩(wěn)定性,I使ES結合緊,I,E洗脫出來.7、親和層析：利用生物大分子物質具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性而建立的層析技術.8、親和膜分離：用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質的方法.9、金屬離子親和層析：利用金屬離子的絡合或形成螯合物的能力吸附蛋白質的分離系統(tǒng).四、回答問題：1、親和層析的原理是什么主要特點是什么原理:1配基固定化：配基與載體偶聯(lián),結合成具有特異親和性的分離介質.2吸附樣品：親和層析介質選擇性吸附生物活性物質.3樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質解吸.特點：經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質；設備要求不高、操作簡便、特異性強、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差,專用的吸附劑.2、對親和層析的公式進行說明.設KL=10-7,求L01對親和層析公式的說明如下：式中,E——被分離的酶,L——配基,EL——復合物,KL——為EL復合物的解離常數(shù)根據(jù)化學反應平衡方程式：式中,Eo和Lo——分別為原始的酶濃度和配基濃度,當Lo＞＞Eo時,Lo-EL≈Lo,則在親和層析中,定義分配比k為：一般柱層析公式為：式中,Ve——蛋白質洗脫體積；Vo——凝膠載體外水體積.由此可導出親和勢與洗脫體積的關系式：2求L0：因為KL=10-7,所以≥10,→L03、何謂“手臂”其長短與親和層析效果有何聯(lián)系為什么“手臂”就是用來消除空間障礙插在載體和配基間的基團.手臂的長度是有限的,不可太短也不可太短也不可太長,太短不能起消除空間障礙的作用,太長往往會使非特異性吸附增加.4、什么是擬生物親和層析其中多