《6種檢測(cè)方法》課件

高效液相色譜六種定量方法原理及使用條件1精選課件六種定量方法1、峰面積百分比法2、峰面積歸一法

3、外標(biāo)法4、雜質(zhì)檢查法5、內(nèi)標(biāo)法加校正因子的主成分自身對(duì)照法

不加校正因子的主成分自身對(duì)照法2精選課件峰面積百分比法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。某化合物百分含量（%）=簡(jiǎn)單的說就是配制溶液，進(jìn)樣，按峰面積百分比法讀取含量。一般系統(tǒng)適應(yīng)性主要考察分離度。（如：雙乙酰阿昔洛韋。D-NAP方法，P4）峰面積Σ峰面積×100%3精選課件優(yōu)點(diǎn)：

快速、簡(jiǎn)單、無需考察系統(tǒng)重復(fù)性（進(jìn)樣量不嚴(yán)格）無需對(duì)照品缺點(diǎn)：

測(cè)定誤差大，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。峰面積百分比法4精選課件峰面積歸一法

在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液（一般為100%限度加樣溶液），進(jìn)樣，記錄色譜圖，按

式中：Ci—加樣溶液中加入的雜質(zhì)百分含量；Ai1—回收異丙醇中雜質(zhì)的平均峰面積；Ai2—加樣溶液中雜質(zhì)的峰面積；Cs—加樣溶液中主成份的百分含量；As—加樣溶液中主成份的峰面積。計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常定位或以主成分為參照，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。5精選課件峰面積歸一法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量各峰的面積，加入校正因子計(jì)算各組分面積及總峰面積。計(jì)算各組分折算后峰面積占總峰面積的百分比。公式如下：

某化合物百分含量（%）=比面積百分比法多了一步校正因子計(jì)算。如雙乙酰阿昔洛韋。若雜質(zhì)含量較少，乘校正因子對(duì)總面積影響較小，可按結(jié)果×校正因子報(bào)告。若雜質(zhì)含量較大或個(gè)數(shù)較多，乘校正因子對(duì)總面積影響較大，需按峰面積乘校正因子重新計(jì)算總峰面積后再計(jì)算。（如：vcv有關(guān)物質(zhì)2等）峰面積×響應(yīng)因子Σ峰面積×響應(yīng)因子×100%6精選課件優(yōu)點(diǎn)：

快速、簡(jiǎn)單、無需考察系統(tǒng)重復(fù)性（進(jìn)樣量不嚴(yán)格）驗(yàn)證時(shí)需對(duì)照品，之后無需對(duì)照品。缺點(diǎn)：

同峰面積百分比法。誤差較大，但比百分比法準(zhǔn)確。峰面積歸一化法7精選課件外標(biāo)法建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：含量（%

）=（CR/CX）(AX/AR)*100式中CR——對(duì)照溶液中待測(cè)組分濃度；CX——供試品溶液中待測(cè)組分濃度；AX——供試品溶液中待測(cè)組分濃度；AR——對(duì)照溶液待測(cè)組分峰面積。

系統(tǒng)適應(yīng)性中需考察重復(fù)性。基本原理：濃度和峰響應(yīng)成線性。（如各產(chǎn)品項(xiàng)下含量方法，CPGBSA雜質(zhì)A、基因毒性雜質(zhì)等）8精選課件外標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)：外標(biāo)法方法相對(duì)內(nèi)標(biāo)法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量準(zhǔn)確。對(duì)照品好找，用待測(cè)組分的純品作為對(duì)照品。不足：1、進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確。此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中成分或雜質(zhì)含量時(shí)，以定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。2、儀器及人員精密度要求較高。需控制實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性。3、定期校正。4、只能每個(gè)待測(cè)組分均需進(jìn)其對(duì)照溶液。但此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。9精選課件雜質(zhì)檢查法1、

加校正因子的主成分自身對(duì)照法已知且有對(duì)照品雜質(zhì)2、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法未知或無對(duì)照品雜質(zhì)已知雜質(zhì)且有對(duì)照品的我們現(xiàn)在都加校正因子，未知雜質(zhì)按1.0計(jì)。

除另有規(guī)定外，校正因子大于等于1.0時(shí)，保留至小數(shù)點(diǎn)后1位，反之，保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位；結(jié)果為0.80~1.2之間，通常按1.0計(jì)，反之，雜質(zhì)濃度計(jì)算時(shí)，應(yīng)乘以測(cè)試得到的校正因子。10精選課件加校正因子的主成分自身對(duì)照法在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，或根據(jù)線性檢測(cè)結(jié)果計(jì)算。

f=或f=計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。A雜/C雜A樣/C樣K樣K雜11精選課件加校正因子的主成分自身對(duì)照法需系統(tǒng)適應(yīng)性考察：1、靈敏度考察：定量限最低要求在雜質(zhì)一半限度以下。（可調(diào)節(jié)進(jìn)

樣濃度或進(jìn)樣量）2、系統(tǒng)適應(yīng)性考察：通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%～2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%3、供試品溶液的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，一般為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍。方法確定后不調(diào)節(jié)。12精選課件加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，進(jìn)樣自身對(duì)照溶液（自身對(duì)照溶液：供試品溶液稀釋至主成分濃度一般為雜質(zhì)限度濃度）

測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。公式為：

雜質(zhì)含量（%）=式中：AIM待測(cè)雜質(zhì)峰面積；

C對(duì)

自身對(duì)照溶液中供試品濃度；A對(duì)

待測(cè)雜質(zhì)峰面積； C供試品

供試品濃度；f校正因子。

Aim*C對(duì)A對(duì)*C供試品*f*10013精選課件不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若沒有雜質(zhì)對(duì)照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法?；境Ｕ蜃硬襟E外，其余同加校正因子自身對(duì)照法14精選課件雜質(zhì)檢查法優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)較準(zhǔn)確。首次驗(yàn)證時(shí)用相應(yīng)對(duì)照品確定校正因子后，樣品檢測(cè)時(shí)只要用供試品作為對(duì)照品。只需定位溶液或RRT定位。節(jié)省雜質(zhì)對(duì)照品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)溶液配制簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)同外標(biāo)法，需較高的儀器人員環(huán)境穩(wěn)定性。

若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品的色譜圖1，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖2.色譜圖1上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖2上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。即扣除空白溶劑法。15精選課件雜質(zhì)檢查法與外標(biāo)法區(qū)別

外標(biāo)法：對(duì)照和待測(cè)組分為同一物質(zhì)，只能校正進(jìn)了對(duì)照溶液的組

分。（主成分對(duì)應(yīng)主成分對(duì)照，雜質(zhì)對(duì)應(yīng)雜質(zhì)對(duì)照）自身對(duì)照法：對(duì)照一般為待測(cè)供試品。（所有待測(cè)組分均對(duì)應(yīng)主成分

對(duì)照）如：阿昔洛韋USP有關(guān)物質(zhì)中鳥嘌呤為外標(biāo)法。其他雜質(zhì)為自身對(duì)照法。16精選課件內(nèi)標(biāo)法1、原理按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子f：f=式中：As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Ar為對(duì)照品的峰面積或峰高；Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；Cr為對(duì)照品的濃度。

f即內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與待測(cè)樣品響應(yīng)比值。需考察儀器響應(yīng)重復(fù)性。即校正因子重復(fù)性。As/CsAr/Cr17精選課件內(nèi)標(biāo)法再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量CX：Cx=f*=*式中：Ax為供試品峰面積或峰高；Cx為供試品的濃度；A′s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；C′s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為校正因子。AxA’s/C’sAs/CsAr/CrAxA’s/C’s18精選課件內(nèi)標(biāo)法1、優(yōu)點(diǎn)：①、在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi)，

采用內(nèi)標(biāo)法（因?yàn)椴捎猛会槺戎祦碛?jì)算），定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無關(guān)。②、只要被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關(guān)。③、很適用于測(cè)定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測(cè)定含量，用內(nèi)標(biāo)法則很方便。加一個(gè)與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進(jìn)樣量突出雜質(zhì)峰，測(cè)定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。

第1條主要針對(duì)外標(biāo)法。2,3兩條主要針對(duì)面積歸一化法。因組分濃度太小時(shí)不能檢出，組分濃度太高時(shí)不能呈線性。19精選課件內(nèi)標(biāo)法2、不足：因內(nèi)標(biāo)物選擇需符合以下要求:

（1）內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分，否則會(huì)使峰重疊而無法準(zhǔn)確測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物的峰面積；（2）化學(xué)性質(zhì)與樣品相似（3）內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。（4）與樣品有相似響應(yīng)值

（5）不會(huì)與樣品發(fā)生反應(yīng)

（6）色譜性質(zhì)穩(wěn)定（7）內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間應(yīng)與待測(cè)組分相近，但彼此能完全分離(R≥1.5)（8）可得到分離良好的，干凈利落的峰故樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋是其缺點(diǎn)。且現(xiàn)在儀器精密度較好，一般不存在儀器精密度問題，故常用外標(biāo)法（含量）或雜質(zhì)檢查法（有關(guān)物質(zhì)）控制

。部分原料中間體會(huì)用面積歸一化法控制。（一般考察線性、靈敏度濃度達(dá)到雜質(zhì)指標(biāo)限度一般以下）20精選課件總結(jié)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用范圍百分比法無需校正進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求檢測(cè)器響應(yīng)需一致所有組分峰都需流出且被檢測(cè)到所有面積積分都需準(zhǔn)確測(cè)定誤差大主要用于原料中間體等對(duì)定量要求不高的產(chǎn)品歸一化法進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求所有組分峰都需流出且被檢測(cè)到所有面積積分都需準(zhǔn)確必須校正所有峰測(cè)定誤差稍大外標(biāo)法校正檢測(cè)器響應(yīng)只對(duì)待檢組分做校正無需所有峰都流出或檢測(cè)進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確儀器及人員環(huán)境都需很好穩(wěn)定性定期校