基因工程的原理和技術(shù)

溫故而知新限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶質(zhì)粒——載體基因工程操作的工具剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)（一）獲得目的基因（二）形成重組DNA分子（三）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（四）目的基因的檢測(cè)和表達(dá)1、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞2、目的基因的表達(dá)步驟一獲得目的基因人工合成(反轉(zhuǎn)錄法)序列：從基因文庫(kù)獲得未知序列：(DNAlibrary)聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PolymeraseChainReaction)氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。在酶的作用下，不斷延伸，合成雙鏈DNA。屢次循環(huán)，獲得大量雙鏈DNA分子。目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）蛋白質(zhì)氨基酸序列推測(cè)mRNA的核苷酸序列推測(cè)結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列化學(xué)合成目的基因人工合成法逆轉(zhuǎn)錄法根據(jù)氨基酸序列直接合成DNA鳥(niǎo)槍法：散彈射擊法供體細(xì)胞DNA限制酶許多DNA片段載入運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生特定性狀分離目的基因從基因文庫(kù)獲得步驟二形成重組DNA分子可能存在情況：目的基因載體步驟三將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.基因工程中常用的受體細(xì)胞有哪些？2.導(dǎo)入過(guò)程如何？大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑受體細(xì)胞：細(xì)菌CaCl2細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制步驟四篩選含有目的基因的受體利用標(biāo)記基因來(lái)篩選：通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因的有無(wú)，〔或利用標(biāo)記基因表達(dá)的性狀〕來(lái)判斷目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。對(duì)目的基因進(jìn)行分子水平的檢測(cè)：步驟五目的基因的表達(dá)1、通過(guò)鑒定目的基因的產(chǎn)物蛋白來(lái)確定目的基因的表達(dá)?？乖c抗體雜交2、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，受體細(xì)胞〔或受體細(xì)胞發(fā)育來(lái)的生物體〕會(huì)表現(xiàn)特定的性狀，通過(guò)性狀的觀察來(lái)確定目的基因的表達(dá)。引入病原體目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、