綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用

綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用

整理ppt熒光現(xiàn)象在許多海洋無脊椎動(dòng)物中普遍存在著。許多刺胞亞門的動(dòng)物和幾乎所有櫛水母類的動(dòng)物在受到刺激時(shí)都可以發(fā)出熒光：刺胞亞門的動(dòng)物多發(fā)射綠色熒光，而櫛水母類發(fā)射藍(lán)色熒光。綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡(jiǎn)稱GFP，它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用被稱為細(xì)胞生物學(xué)上的一次革命。這種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)很特殊，在受到藍(lán)光或紫外線刺激時(shí)可以發(fā)射綠色熒光，并不需要任何協(xié)同因子、底物，適合用作普遍的報(bào)告標(biāo)記，尤其適合于活體細(xì)胞或組織。由于GFP穩(wěn)定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反響不需要任何外源反響底物及表達(dá)無物種或細(xì)胞組織的專一性,檢測(cè)簡(jiǎn)單，結(jié)果真實(shí)可靠，是一種獨(dú)特的報(bào)告蛋白(Reporterprotein)?？蓮V泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞的別離與純化等研究領(lǐng)域。整理ppt圖1綠色熒光蛋白整理ppt1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先從一種水母類動(dòng)物AequoreaVictoria中別離純化出了GFP,1992年P(guān)rasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一級(jí)結(jié)構(gòu),1994年M.Chalfie[3]等最早用重組野生GFP型基因做報(bào)告基因,成功地在原核和真核生物中得到表達(dá)。90年代后,人們對(duì)GFP的性質(zhì)和應(yīng)用進(jìn)行了不斷深入的研究,有關(guān)GFP及其利用的研究進(jìn)展較快，現(xiàn)在它已經(jīng)開展成了現(xiàn)代生物學(xué)研究的一個(gè)精確工具。目前在細(xì)胞生物學(xué)、植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科研究中都有著相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。隨著人們對(duì)GFP發(fā)光機(jī)制研究的深入,通過對(duì)其發(fā)光團(tuán)區(qū)域和其它區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變,已經(jīng)得到了許多GFP突變型,有的發(fā)藍(lán)光或黃光而不是綠光[4]；有的發(fā)出的熒光比野生型的強(qiáng)很多,激發(fā)后很容易用肉眼觀察到；有的那么是溫度突變型,其表達(dá)不受溫度的限制[5]；有的突變體那么可以特異地在某些物種中高效表達(dá)。這些突變體極大地拓寬了GFP的應(yīng)用范圍,使GFP在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用顯示出更為廣闊和誘人的前景。整理ppt一、GFP的結(jié)構(gòu)

圖2綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)整理pptGFP編碼238個(gè)氨基酸的多肽單體，只有完整的GFP分子才會(huì)產(chǎn)生生物熒光，被切斷的GFP(即使是C、N末端的少數(shù)幾個(gè)氨基酸)亦能導(dǎo)致GFP失去發(fā)光能力[6]。與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP分子中一小段被稱為熒光生色團(tuán)(Chromophore)的部位[7]。在GFP的初級(jí)氨基酸序列上，第65～67個(gè)氨基酸(Ser-Tyr-Gty)形成環(huán)狀三肽，以共價(jià)形式與GFP蛋白肽鍵骨架相連。生色團(tuán)的形成不受種屬的限制，其通過細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的成分的作用或通過自催化作用都能產(chǎn)生。熒光生色團(tuán)非常穩(wěn)定,不易變性,用酸、堿處理或者參加鹽酸胍都不會(huì)使它失去熒光。但是當(dāng)pH值恢復(fù)到中性或者移去變性物時(shí)，它的熒光又會(huì)恢復(fù)到變性前的水平。GFP的生色團(tuán)之間是通過共價(jià)鍵結(jié)合。生色團(tuán)形成的機(jī)理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的條件下，酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸，并環(huán)化形成六肽，這可能是形成色基的必然過程。[8]整理ppt二、GFP的應(yīng)用特點(diǎn)1易于檢測(cè)GFP熒光反響不需外加任何反響底物，酶或其它共反響因子,也就不存在這些物質(zhì)可能難于進(jìn)入細(xì)胞的問題，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā),即可發(fā)出綠色熒光，GFP發(fā)射的熒光用肉眼或熒光顯微鏡就可以檢測(cè)到。靈敏度高,對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別,同時(shí)還可利用其進(jìn)行定量檢測(cè)。由于GFP對(duì)活細(xì)胞根本無毒害,因此無須特殊處理就可以很方便地進(jìn)行活體觀察。而且，具有不同光譜特性的GFP突變體的獲得,使在同一細(xì)胞中同時(shí)分析兩種不同蛋白或啟動(dòng)子成為可能,可以用于發(fā)育細(xì)胞學(xué)、藥物篩選、分析診斷等研究。這就使GFP有可能成為一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的標(biāo)記蛋白，GFP基因作為報(bào)道基因可能有廣泛的用途。整理ppt2熒光穩(wěn)定GFP無光漂白現(xiàn)象，在很大的pH范圍內(nèi)(pH7～12)都可以正常發(fā)出熒光，受溫度的影響也很小，只有在超過65℃時(shí)才會(huì)變性，熒光消失。熒光顯微鏡強(qiáng)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)[9]。特別在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定,但在340～390nm或395～440nm范圍內(nèi)，仍會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間光照，GFP也有很好的耐受性，根據(jù)Sheen等的研究，GFP在受體內(nèi)表達(dá)時(shí)可以持續(xù)得到不低于10分鐘的熒光。整理ppt3廣譜性首先表現(xiàn)在它的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得了成功的表達(dá)；其次就是沒有細(xì)胞種類和位置的限制，在各個(gè)部位都可以表達(dá)，發(fā)出熒光。整理ppt4易于載體構(gòu)建由于GFP較小，只含有238個(gè)氨基酸，編碼GFP的基因序列也較短，約2.6kb，所以它可以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。盡管野生型的GFP在某些植物和動(dòng)物中表達(dá)很弱，但可通過更換GFP生色團(tuán)氨基酸、改變堿基組分、除去內(nèi)含子、更換強(qiáng)啟動(dòng)子等方法加強(qiáng)表達(dá)。Connack等篩選出了三種含Ser65突變的突變體，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，熒光強(qiáng)度比野生型高約100倍。整理ppt5無毒害Chalfie等的研究說明：GFP對(duì)生活細(xì)胞根本無毒害，Sheen等(1995)的研究進(jìn)一步說明：在玉米中，即便GFP在細(xì)胞中的表達(dá)量很高時(shí)，對(duì)細(xì)胞也不會(huì)產(chǎn)生明顯毒害。但是至今我們還不太了解它對(duì)植物再生能力的影響。整理ppt三、GFP在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用1對(duì)細(xì)胞生理過程的監(jiān)控在過去的幾年中，通過隨機(jī)和人工誘變得到了許多不同顏色的GFP突變體。通過基因操作，許多蛋白都成功的與GFP進(jìn)行了融合，通過這些融合蛋白就可以對(duì)相應(yīng)蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)及生理反響進(jìn)行監(jiān)控。目前GFP融合蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)迅速的生理反響的報(bào)告大概有三種方式：轉(zhuǎn)移和定位、GFP光譜的生化修飾、熒光共振的能量轉(zhuǎn)移(FRET)。Shen[10]等在培養(yǎng)的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+瞬間變化就會(huì)引起GFP標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可逆地易位到突觸后膜的densities上。Shi[11]等用GFP標(biāo)記來監(jiān)控α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)的受體，發(fā)現(xiàn)它會(huì)從細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到樹突棘的外表，根據(jù)突觸中AMPA受體的含量可以解釋突觸沉默、活化的原因和機(jī)制。Siegel[12〕等將野生型的GFP插人ShakeK十通道的特殊部位，形成一個(gè)異源嵌合體，這個(gè)嵌合體發(fā)出的熒光將會(huì)隨著細(xì)胞的去極化作用而緩慢的減少。相反，Yanagawa[13]等將β-內(nèi)酰胺酶插人GFP得到了一個(gè)融合體，當(dāng)此融合體與β-內(nèi)酰胺酶抑制肽(BLIP)結(jié)合時(shí),它的熒光發(fā)射量會(huì)大大增加。整理ppt2細(xì)胞篩選基于GFP能夠吸收、發(fā)射光，并且熒光穩(wěn)定以及檢測(cè)方法快速、方便的特性，GFP在細(xì)胞篩選上應(yīng)用廣泛。譬如應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來篩選蛋白產(chǎn)量增強(qiáng)的細(xì)胞。Yuk等[14]使用GFP作為標(biāo)記能快速篩選出在生長(zhǎng)抑制環(huán)境下，仍能保持重組蛋白大量表達(dá)的CHO細(xì)胞。另外，研究發(fā)現(xiàn)通過GFP熒光的減少，可以測(cè)量出鼠和人細(xì)胞的凋亡[15]。利用GFP融合蛋白作為細(xì)胞外表活體熒光標(biāo)記，通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的E.coli、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞等特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢，第一類與對(duì)照相似，呈現(xiàn)紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù)66.3%；第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度是對(duì)照的74倍[16]。因此，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或熒光活化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACS)很容易將兩類細(xì)胞別離開來。整理ppt3細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子的定位對(duì)于許多蛋白質(zhì)來說，易位是它們激活機(jī)制中的一局部。以前多是用細(xì)胞分級(jí)別離和免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)進(jìn)行研究，而現(xiàn)在利用GFP融合蛋白的顯像技術(shù)無疑是一種簡(jiǎn)便而可靠的檢測(cè)方法，我們不僅可以更快地而且可以更全面地對(duì)蛋白質(zhì)的移動(dòng)進(jìn)行研究。近幾年,在GFP技術(shù)的進(jìn)步中最重要的就是對(duì)幾個(gè)GFP突變體的鑒定。通過標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡，根據(jù)它們所發(fā)出的不同顏色的熒光，就可以在活細(xì)胞中同時(shí)而準(zhǔn)確的區(qū)分多種不同的熒光融合蛋白以及了解它們的分布情況[17]。在實(shí)際中，常用藍(lán)綠色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)兩種突變體的組合來在活細(xì)胞中進(jìn)行雙色顯示。而其他的突變體如藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和紅色熒光蛋白(RFP)的使用還受到許多限制，因?yàn)樗鼈冇泻芸斓墓馄鬃饔没蛘呤前l(fā)射的熒光強(qiáng)度太低。最近又發(fā)現(xiàn)GFP是一個(gè)良好的細(xì)胞間信號(hào)傳遞的動(dòng)態(tài)標(biāo)記分子,可以跟蹤觀測(cè)第二信使,如Ca2+和cAMP水平的起伏變化,細(xì)胞間隙pH值的變化等[18]。整理ppt4用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)研究研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)主要有兩種：光漂白熒光恢復(fù)法(FRAP)、光漂白熒光損失法(FLIP)。FRAP主要是通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定的點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行強(qiáng)烈的光照，使熒光發(fā)生光漂白作用，再通過相同時(shí)間間隔的光影像采樣記錄下熒光恢復(fù)的動(dòng)力學(xué)過程。FRAP不僅可以確定細(xì)胞器上的蛋白，還可以確定流動(dòng)蛋白的滯留時(shí)間。轉(zhuǎn)錄、m-RNA前體的剪切、DNA的修復(fù)中蛋白質(zhì)復(fù)合體操作機(jī)制都可以用這種方法來研究。FLIP是對(duì)細(xì)胞的一個(gè)區(qū)域進(jìn)行持續(xù)性的光漂白，再對(duì)光漂白區(qū)外的熒光的損失進(jìn)行監(jiān)控就可以獲得一些標(biāo)記蛋白之間的相關(guān)性信息。目前正在體外通過改變光照點(diǎn)的大小和固定細(xì)胞來研究光漂白作用的可逆性，不過還是與活細(xì)胞的環(huán)境有一定的差距。另外一種可以用來研究細(xì)胞內(nèi)反響動(dòng)力學(xué)的方法就是熒光相關(guān)性分光光鏡檢查(FCS)。這種方法是首先通過聚焦照射在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)一定大小的光洞，光洞中熒光探針的移動(dòng)會(huì)引起熒光的波動(dòng)，通過校正計(jì)算出熒光顆粒的平均滯留時(shí)間和平均數(shù)量，再根據(jù)光洞的大小和平均光滯留時(shí)間就可以計(jì)算出擴(kuò)散蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)[19]。整理ppt5計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)速度在高水平組合型表達(dá)GFP的細(xì)胞品系中,在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期,綠色熒光蛋白所發(fā)出的熒光信號(hào)與細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)。測(cè)量到的任何熒光強(qiáng)度都可以相應(yīng)地轉(zhuǎn)變成細(xì)胞濃度。盡管在細(xì)胞生長(zhǎng)的后期,用熒光信號(hào)計(jì)算得到的細(xì)胞數(shù)目略低于培養(yǎng)物中的實(shí)際數(shù)目。但在常用的臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)方法中,這個(gè)誤差是允許的。利用這一技術(shù),可以測(cè)定某些細(xì)胞的分布和生長(zhǎng)狀況,尤其是一些透明的動(dòng)物和植物組織內(nèi)特定細(xì)胞、化合物的生長(zhǎng)、分布情況。也有人用此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行病毒在植物體內(nèi)的生長(zhǎng)、擴(kuò)散情況的研究,取得了不錯(cuò)的效果。整理ppt6.觀察細(xì)胞內(nèi)酶的活動(dòng)

GFP突變子不僅僅可以用來探測(cè)融合蛋白的空間定位，而且可以對(duì)活細(xì)胞的酶活動(dòng)，如：磷酸化作用、蛋白水解作用等進(jìn)行報(bào)告，還可以測(cè)量與酶活動(dòng)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)的pH、cAMP、Ca2+濃度。通過將外源序列插人GFP基因中，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶的活動(dòng)進(jìn)行觀察以及了解這些酶的生理學(xué)參數(shù)。插入外源基因后所表達(dá)的融合蛋白中的GFP蛋白發(fā)色基團(tuán)會(huì)發(fā)生構(gòu)像改變，其發(fā)射的熒光的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很大的變化。這些指示劑可以用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)許多酶的作用，例如：蛋白水解酶、激酶、氧化復(fù)原酶以及一些小配基的濃度[20]。整理ppt7用于細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)研究利用GFP的熒光可以清楚地對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行追蹤。體內(nèi)腫瘤侵襲的研究要求在周圍正常細(xì)胞背景下，能識(shí)別少量甚至是單個(gè)的瘤細(xì)胞。以往用抗腫瘤細(xì)胞特異性抗原、抗體進(jìn)行免疫組化分析，操作較為復(fù)雜,且對(duì)抗原性有較高要求。利用β半乳糖昔酶(LacZ)作為標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，操作較為復(fù)雜，且需底物分子。而用GFP就可以準(zhǔn)確而簡(jiǎn)便地對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行示蹤。李俠【21】等將攜有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的pEGFP-N3質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆，以立體定向法植入SD大鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)建立大鼠移植瘤模型。4周后處死大鼠并作鼠腦連續(xù)石蠟切片,相鄰的切片分別做蘇木素-伊紅(HE)或免疫組化染色后熒光顯微鏡下檢測(cè)。在熒光顯微鏡很容易區(qū)分腫瘤區(qū)和非腫瘤區(qū)，并能發(fā)現(xiàn)侵襲至遠(yuǎn)處的單個(gè)腫瘤細(xì)胞，其敏感性和特異性明顯優(yōu)于HE染色和免疫組化方法。朱君明[22]等將GFP和HTH1雙基因的多基因表達(dá)載體GC-GFP-P-HTH1-SN轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，且移植人Parkinon病模型大鼠紋狀體內(nèi)后，也清晰地觀察到了NIH-3T3細(xì)胞在腦內(nèi)的生長(zhǎng)情況。Xin[23]等將EGFP轉(zhuǎn)人EG4細(xì)胞(一種原胚細(xì)胞)中，建立了幾株既可以表達(dá)綠色熒光蛋白又依然保持了多能干細(xì)胞特征的EG4-GFP細(xì)胞系，通過對(duì)聚集的EG4-GFP細(xì)胞到8細(xì)胞胚胎的研究,可以追蹤到EG4-GFP細(xì)胞在體外分化情況以及在胚胎發(fā)育中的命運(yùn)。整理ppt8.基因表達(dá)調(diào)控Clontech公司構(gòu)建了一種叫啟動(dòng)子報(bào)告載體(Promoterreportervector)即是一個(gè)沒有啟動(dòng)子的GFP質(zhì)粒，專門用來測(cè)試各種啟動(dòng)子對(duì)GFP表達(dá)的效率，以及某些增強(qiáng)子對(duì)GFP表達(dá)的調(diào)控效果。發(fā)現(xiàn)用玉米C4PPDK基因5'端的非翻譯片段(5'VTR)與花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子連接，GFP在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)效率比對(duì)照質(zhì)粒(只有35S啟動(dòng)子)提高近15倍，因?yàn)?'VTR片段中含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。用擬南芥菜熱休克(Heat-shock)基因啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體，用以轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。發(fā)現(xiàn)42℃熱激處理中50%原生質(zhì)體表達(dá)GFP熒光，37℃處理的熒光較弱，而常溫下培養(yǎng),那么完全觀察不到原生質(zhì)體中的GFP熒光[24]。在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)調(diào)控研究中，已有很多報(bào)告蛋白被應(yīng)用，包括LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT〔Chloramphenicolacethytransferase〕,Luc(熒光蟲Luciferase)和GUS(β-glucuronidase)等。但這些報(bào)告蛋白都是酶，其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)都需要進(jìn)行細(xì)胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理，很難用于活體觀察和檢測(cè)。GFP作為一種活體報(bào)告蛋白，用于研究基因表達(dá)的調(diào)控，明顯具有其它報(bào)告蛋白不可替代的優(yōu)點(diǎn)。整理ppt9.定量分析GFP的熒光強(qiáng)度很高，很容易用儀器定量檢測(cè)，而且研究說明GFP的熒光強(qiáng)度和與其相連的細(xì)胞或蛋白有一定的相關(guān)性，只需要做出一條相關(guān)性曲線，就可以對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行定量的分析。Hack[19]等將用GFP標(biāo)記的神經(jīng)元特異性鈣調(diào)蛋白calretinin(CR)基因轉(zhuǎn)人畸胎癌細(xì)胞中，通過對(duì)微血管中GFP熒光的測(cè)量，再做出GFP和CR含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算出CR的表達(dá)量。Mcore[25]等將GFP在體外轉(zhuǎn)染9L膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞后接種于Fisher大鼠腦內(nèi)，2周后處死大鼠，進(jìn)行鼠腦標(biāo)本切片和熒光顯微鏡觀測(cè)，無熒光標(biāo)記的暗區(qū)(blackspots)為腫瘤血管區(qū)，由此可計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量。整理ppt10GFP報(bào)告蛋白用于細(xì)胞活體別離與純化利用細(xì)胞外表標(biāo)記，通過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(FACS)，可以別離與純化特殊類型細(xì)胞，對(duì)分析cDNA文庫(kù)、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表達(dá)十分重要[26,27]。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞外表活體熒光標(biāo)記，通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體的流體參數(shù)分析中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染15～18小時(shí)后，對(duì)照中只有一類細(xì)胞叢，表現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光和微弱的綠色熒光，并且細(xì)胞間熒光強(qiáng)度相當(dāng)一致，沒有明顯差異。而GFP轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢，第一類與對(duì)照相似，呈現(xiàn)紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù)66.3%；第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度是對(duì)照的74倍。因此，用流式細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很容易將兩類細(xì)胞別離開來。原生質(zhì)體可以來源于不同類型的組織細(xì)胞原生質(zhì)體表達(dá)的GFP信息，即可代表某種組織的信息。采用發(fā)育專一性啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體，可以將這些具有基因表達(dá)特異性的細(xì)胞類型別離出來。利用不同表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，通過流體參數(shù)分析和細(xì)胞分類，可以揭示在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中所包含的許多反方活化因子(trans-activatingfectors)。GFP在生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的利用還不僅僅局限于上述幾個(gè)方面。隨著研究的深入開展，其廣泛利用的潛力將不斷表現(xiàn)出來。整理ppt四、存在的問題及展望GFP標(biāo)記蛋白有很明顯的優(yōu)點(diǎn)，但這項(xiàng)技術(shù)還是有很多的局限性。第一，這種方法需要很高的空間分辨力，培養(yǎng)的細(xì)胞要稀疏而且很?。坏诙?，定量的范圍會(huì)受到融合蛋白表達(dá)水平和顯像分辨力的干擾；第三，因?yàn)槿诤系鞍讛U(kuò)散到膜外表需要一定的時(shí)間，因此動(dòng)力學(xué)響應(yīng)在某些情況下可能會(huì)受到時(shí)間上的限制；第四，由GFP標(biāo)記物本身引起的電勢(shì)干擾是很難估計(jì)的，因?yàn)閹缀鯖]有其它的方法可以用來做比較；第五，幾乎在所有的情況下,細(xì)胞內(nèi)GFP標(biāo)記分子的表達(dá)都伴隨著一些未標(biāo)記蛋白的表達(dá)。例如,組成高爾基反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膜蛋白TGN38，它的正確功能定位和動(dòng)力學(xué)過程需要在同源系統(tǒng)中低水平的表達(dá)，而在非同源系統(tǒng)中表達(dá)或在同源系統(tǒng)中高水平表達(dá)，那么會(huì)導(dǎo)致其斷裂或被錯(cuò)誤地定位[28]。第六，GFP的分子量雖然不大(27kDa)，但對(duì)蛋白功能的影響比一些短的(大約10個(gè)氨基酸)熒光標(biāo)記蛋白要大。最后，雖然有報(bào)道指出，熒光只能在表達(dá)GFP的細(xì)胞中檢測(cè)到，但是也有不少人擔(dān)憂GFP基因可能還不能完全準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)化情況，GFP基因的表達(dá)可能有假象存在：一方面，細(xì)胞本身存在一些可以受光激發(fā)的物質(zhì)，能產(chǎn)生一定量熒光；另一方面，GFP基固在受體內(nèi)的表達(dá)頻率并不高。Sheen等(1995)在一些被CABGFP基因轉(zhuǎn)化的植株中檢測(cè)不到清晰的熒光信號(hào)。Hu、Sheen、Haselof等l995年在發(fā)表的文章中也分別提到了這一現(xiàn)象，看來GFP的應(yīng)用條件還需進(jìn)行進(jìn)一步的摸索。GFP成像技術(shù)是生化和分子細(xì)胞生物學(xué)中飛速開展的一個(gè)工具,它已經(jīng)滲透到了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、生理學(xué)等其它許多生命科學(xué)領(lǐng)域。有了GFP，培育出奇特的熒光動(dòng)物和熒光植物已不再是夢(mèng)想。相信隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)的日益成熟，GFP一定可以為我們揭開細(xì)胞中許多迄今為止還不為人所知的秘密,掀起一場(chǎng)生物學(xué)上的綠色革命。整理ppt參考文獻(xiàn)[1]ShimomuraO,JhsonFH,SaigaY,etal.,1962,J.Cell.Comp.Physiol,59:223.[2]PrasherD,EckenrodeV,WardW,et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