臨床微微生物標(biāo)本的采集注意事項、接種及涂片染色

微生物標(biāo)本的采集、接種及涂片染色湖南省第二人民醫(yī)院檢驗科黃露萍1一、標(biāo)本采集和運送標(biāo)本采集和運送是細(xì)菌培養(yǎng)成功的最最重要的環(huán)節(jié)但由于標(biāo)本的采集和運送常有護(hù)士或醫(yī)生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問題所在之處，造成的后果是：陽性率低、標(biāo)本污染（臨床最不能接受的問題）2（一）痰標(biāo)本的采集1、標(biāo)本采集時間：用抗生素前2、標(biāo)本采集方法：2.1吸痰：通過氣管切口直接將痰吸出，只適用于氣管切開患者。2.2雙套管毛刷防污染吸痰（PSB）：這是最好、最科學(xué)的取樣方法，但缺點是有創(chuàng)傷性檢查，病人不易接受。2.3肺泡灌洗液：對肺心病、呼衰病人有一定的危險。2.4咳痰：是最簡單的方法，但污染嚴(yán)重，影響結(jié)果判斷。3（二）泌尿標(biāo)本的采集1、采集后的標(biāo)本應(yīng)立即送檢。2、采集時間：多數(shù)藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應(yīng)在用藥前采集。應(yīng)采集早晨第一次的尿。3、標(biāo)本管不應(yīng)含防腐劑和消毒劑。4、采集中段尿時要先用肥皂清洗女性的外陰和男性的外生殖器包括包皮內(nèi)，然后用清水沖洗。5、長期留置導(dǎo)尿管的患者應(yīng)在更換新管時留取尿標(biāo)本。4（三）分泌物的采集1、對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。5（三）分泌物的采集2、閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時送檢應(yīng)運用輸送培養(yǎng)基。6（四）便標(biāo)本的采集1、采集時間：腹瀉患者應(yīng)在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應(yīng)在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2、采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內(nèi)或直接盛于增菌液或保存液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培養(yǎng)基中送檢。73、注意事項⑴雖然糞便標(biāo)本本身含很多細(xì)菌但也要用無菌容器。⑵在患者病情許可的條件下應(yīng)在用藥前采集標(biāo)本。⑶應(yīng)床邊接種或置輸送培養(yǎng)基送檢。⑷厭氧細(xì)菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)盡量減少與空氣接觸。8（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集1、采血時間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2、采血量：采一次或采一瓶是錯誤的，至少應(yīng)采一套2瓶，分需氧和厭氧。2瓶血量不少于16-20ml，先將10ml注入需氧瓶，再將剩余血采血注入?yún)捬跗俊?、采血方法：不要與血氣和血沉標(biāo)本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口采血。9（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集4、采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培養(yǎng)標(biāo)本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥。5、兒童：采血量是總血量的1%。6、延遲培養(yǎng)瓶處理:延遲培養(yǎng)瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細(xì)菌室。7、皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。10關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35℃的溫箱。過夜不會對檢測造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入生長對數(shù)期，從而錯過檢測的最佳時期。11血標(biāo)本采集間隔時間對于非持續(xù)性菌血癥，同時或短時間內(nèi)采集2－3套血培養(yǎng)，因為體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)會在15～30min內(nèi)清除掉進(jìn)入人體內(nèi)的細(xì)菌?？梢杉毙孕膬?nèi)膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內(nèi)完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立即進(jìn)行抗菌藥的經(jīng)驗治療。如果24小時內(nèi)報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。12血標(biāo)本采集間隔時間可疑的亞急性心內(nèi)膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標(biāo)本。如果24小時內(nèi)報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。13抽血量和體重的關(guān)系2-340-60>=36.322012.8-36.3262.1-12.7241.1-211-2<1套（需氧+厭氧）抽血量ml體重Kg14腦脊液標(biāo)本的采集無菌操作，由醫(yī)生腰椎穿刺采樣最少1mL，最好>5mL打入3個小管中，以第一根小管送檢培養(yǎng)

即時送檢，一般不能超過1小時。絕對不能冷藏！15二、樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)

1、樣本上無病患標(biāo)簽或病患標(biāo)簽與檢驗申請單不符合。2、樣本以不適當(dāng)?shù)臏囟?、運送培養(yǎng)基及容器送。3、樣本的量不足、已被防腐劑固定和運送時間過長。4、樣本外漏、容器破損及明顯受污染的樣本。5、樣本的檢驗項目申請不適合進(jìn)行。

16二、樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)6、當(dāng)日重復(fù)送樣本（除血液培養(yǎng)外）。7、痰標(biāo)本涂片，白細(xì)胞<10，上皮細(xì)胞

>25。8、尿液標(biāo)本培養(yǎng)，標(biāo)本量太少（少于

10ml）。9、糞標(biāo)本培養(yǎng)，放置時間過長，已干。

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三、分離培養(yǎng)基本操作規(guī)范合格的標(biāo)本是保證培養(yǎng)成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境以及正確的處理方法同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本操作規(guī)范以保證致病細(xì)菌分離成功。18

（一）平板的劃線分離方法191、分區(qū)劃線分離法圖示202、連續(xù)劃線分離法213、Maki滾動法22錯誤涂法23（二）正確的培養(yǎng)基放置方法1、加蓋、倒置（底朝上）3、放置于合適的培養(yǎng)環(huán)境2、不可疊加太高（不超過4個）

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（三）各種標(biāo)本的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件251、痰標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂。⑵

培養(yǎng)環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基置35℃空氣培養(yǎng)。⑶

真菌培養(yǎng)：沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，28℃空氣培養(yǎng)。262、尿標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭。⑵

菌落計數(shù)：每個標(biāo)本都要做，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本10ul分別接種于上述培養(yǎng)基均勻涂布整個平皿，次日作菌落計數(shù)。⑶

培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)273、大便標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：中國蘭、SS瓊脂。⑵

培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。⑶

疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂，5%羊血瓊脂置35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。沙保弱瓊脂置28℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。其他特殊腸道致病菌培養(yǎng)按國家CDC要求執(zhí)行。

284、分泌物標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。295、靜脈導(dǎo)管尖端標(biāo)本靜脈導(dǎo)管尖端：培養(yǎng)靜脈導(dǎo)管尖端是為了明確細(xì)菌來源。最常用的方法是半定量的方法，方法是用5cm長的導(dǎo)管末端部分在血液瓊脂平板上滾動4次。培養(yǎng)物出現(xiàn)15個以上的菌落，提示有潛在的導(dǎo)管相關(guān)性感染。30導(dǎo)管尖端陽性培養(yǎng)結(jié)果316、腦脊液標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、葡萄糖肉湯⑵

培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。327、膽汁或胸水或腹水標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：如標(biāo)本量大時可按血液培養(yǎng)方法直接取16-20ml分別種入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。如標(biāo)本量有限，可接種5%羊血瓊脂、中國蘭、葡萄糖肉湯。。⑵

培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。338、膿液標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭。⑵

培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。349、生殖道標(biāo)本普通細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本接種：

⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。淋球菌標(biāo)本的接種：

⑴

培養(yǎng)基：接種于專用MTM平皿上。⑵培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。35四、細(xì)菌涂片操作規(guī)范36涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢1、染色一般程序制備涂片標(biāo)本→染色372、固定的目的和方法使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固可改變菌體對染料的通透性加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全固定的方法將制成的標(biāo)本勻速通過火焰三次383、染色應(yīng)具備最基本的染色技術(shù)，即革蘭氏染色、抗酸染色和墨汁染色。⑴

革蘭染色：革蘭染色報告必須包括染色反應(yīng)或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。39革蘭染色原理細(xì)菌的等電點較低，約在pH2～5之間，故在中性、堿性或弱堿性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的堿性染料如龍膽紫及堿性復(fù)紅等結(jié)合，使細(xì)菌被染成紫色或紅色。40①龍膽紫液染10s（染料著染）

→水洗

②碘溶液染10s

（媒染劑媒染）→水洗

③丙酮酒精脫色10~20s

（脫色劑）→水洗

④稀釋的石炭酸復(fù)紅10s

（復(fù)染）→水洗

→干燥→鏡檢。

革蘭氏染色步驟41革蘭氏染色注意事項

①革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。②菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

③不要涂片太厚，會造成假陰性或假陽性。42

紅色革蘭陰性菌、紫色革蘭陽性菌43鏈狀的革蘭陽性球菌：提示鏈球菌短鏈，<6個細(xì)胞，提示腸球菌或B群鏈球菌；肺炎鏈球菌血培養(yǎng)中長鏈的革蘭陽性球菌（>6個細(xì)胞）提示化膿鏈球菌或草綠色鏈球菌革蘭氏陽性球菌44呈堆或四聯(lián)排列的革蘭陽性球菌提示葡萄球菌

革蘭氏陽性球菌45革蘭氏陰性球菌46外型奇特的酵母菌，不要遺忘革蘭陰性桿菌。47痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)標(biāo)本實驗室在接種前必須作痰涂片革蘭染色，當(dāng)在低倍鏡下白細(xì)胞≤10個／L、上皮細(xì)胞≥25個／L時應(yīng)作為不宜做培養(yǎng)的標(biāo)本；當(dāng)白細(xì)胞≤10個／L，上皮細(xì)胞≤25個／L時再參照油鏡觀察標(biāo)本中細(xì)菌分布作出判斷。48痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)標(biāo)本中細(xì)菌種類超過3種以上，未見到釬毛拄狀上皮細(xì)胞，作為不合格標(biāo)本；如見到數(shù)量不等的白血胞或釬毛拄狀上皮細(xì)胞或兩者同在，含1-2種不同細(xì)菌，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果可根據(jù)病情再作分析；當(dāng)涂片中見到1-3種細(xì)菌，少量的扁平上皮細(xì)胞，少量或較多釬毛拄狀上皮細(xì)胞均可按合格標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。49痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）膿細(xì)胞>+++，鱗狀上皮細(xì)胞≤+，細(xì)菌種類

<3種，可視為理想的痰標(biāo)本。無膿細(xì)胞或膿細(xì)胞極少時，以見到柱狀上皮細(xì)胞為準(zhǔn)。（2）膿細(xì)胞>+++，<++鱗狀上皮細(xì)胞≥+，細(xì)菌種類<3種，也可用于培養(yǎng)。（3）膿細(xì)胞<+，鱗狀上皮細(xì)胞>+++，細(xì)菌種類

>4種，視為不合格標(biāo)本，應(yīng)予以退回，重新送檢。50用革蘭氏染色來評估呼吸道標(biāo)本是否合格>10鱗狀上皮細(xì)胞/LPF——拒收！彈性纖維，中性粒細(xì)胞多，鱗狀上皮細(xì)胞少，有代表性的好標(biāo)本51纖毛拄狀上皮細(xì)胞52細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌53⑵

抗酸染色抗酸染色報告應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報告中應(yīng)以加號體現(xiàn)標(biāo)本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標(biāo)本。不能報告找到結(jié)核桿菌但可報告未找到結(jié)核桿菌54

抗酸染色染色步驟①

初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。也可不加熱染色5分鐘或更久，用水沖洗。②

脫色：3%鹽酸酒精脫色1~2分鐘，用水沖洗。③

復(fù)染：用亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染30s~1分鐘，用水沖洗后用吸水紙吸干。55

抗酸染色注意事項①

無菌操作②

涂片厚度要適中③

染色時間要充分④

脫色是關(guān)鍵步驟，要徹底⑤

初染加熱勿沸騰勿干涸。56形態(tài)：細(xì)長，略彎曲的桿菌，常堆積成團，排列無序，偶可見呈分枝狀生長，無鞭毛和芽胞。染色性：不易著色，抗酸染色陽性。菌體呈紅色，背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。結(jié)核分枝桿菌57結(jié)核分枝桿菌58結(jié)核分枝桿菌59結(jié)核分枝桿菌60涂片結(jié)果報告標(biāo)準(zhǔn)陰性300視野0條報告菌數(shù)300視野1～8條陽性