PTIO和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)操作指南-李熙燦-曾婧媛

PTIO和ABTS自由基的清除實(shí)驗(yàn)操作指南（以槲皮素為例）【前言】PTIO和ABTS自由基簡(jiǎn)介PTIO是與人體內(nèi)自由基較為相似的氧自由基;而ABTS是氮自由基，雖然主要元素不同，但它們都較為穩(wěn)定且隨著被清除都會(huì)造成在特定波長(zhǎng)下吸光度減小，所以常被用于檢測(cè)物質(zhì)體外抗氧化能力強(qiáng)弱。本文詳細(xì)介紹了這兩種自由基清除實(shí)驗(yàn)的操作方法，并附有實(shí)例。其中，PTIO自由基可以用于檢測(cè)活性氧的清除能力；而ABTS自由基則適于檢測(cè)活性氮的的清除能力。（A）（B）（C）（D）圖1.（A）PTIO自由基結(jié)構(gòu)式（B）ABTS自由基結(jié)構(gòu)式（C）PTIO分子模型（不同角度）（D）ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3DPro14.0軟件繪制）【實(shí)驗(yàn)方法】1.PTIO自由基清除[1]1.1溶液的配置PTIO試液：3mgPTIO固體+20mL甲醇超聲，混勻PTIO測(cè)試液取80LPTIO測(cè)試液和20mL甲醇（與PTIO測(cè)試液中溶劑一致）混勻，在557nm處測(cè)定吸光度，使吸光度保持在0.350.01之間。吸光度偏大或偏小，就調(diào)節(jié)原PTIO測(cè)試液的濃度，使吸光度保持為0.350.01。此吸光度為A0。樣品液：用合適溶劑溶解（一般為95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可適當(dāng)超聲使之完全溶解，混合均勻。1.2預(yù)實(shí)驗(yàn)取80mL的PTIO試液，往其中加少量樣品液，加樣時(shí)，緩慢少量加入，邊加邊混合，并觀察溶液褪色情況，當(dāng)溶液剛剛好褪色完全，記下此時(shí)樣品的加樣量。此加樣量即為樣品最大加樣量，在此最大用量基礎(chǔ)上，往前設(shè)置5個(gè)用量使之成為等差數(shù)列。（如，如果最大加樣量為20mL，那么對(duì)于該樣品而言，其用量梯度宜設(shè)為0mL、4mL、8mL、12mL、16mL、20mL）注意事項(xiàng)：預(yù)實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到樣品最大加樣量很?。ǖ陀?0mL），此時(shí)應(yīng)該降低原樣品液的濃度，再做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果最大加樣量低于10mL，可能不會(huì)得到很好的量效關(guān)系曲線。預(yù)實(shí)驗(yàn)中也可能會(huì)遇到樣品最大加樣量很大（大于20mL），或者不能立即褪色，此時(shí)可以將溶液37℃水浴2小時(shí)后再觀察，若褪色效果仍不明顯，應(yīng)加大原樣品液濃度再做預(yù)實(shí)驗(yàn)。1.3A值測(cè)量用移液槍取PTIO試液80mL加入到96孔板，加樣品液xmL（x是根據(jù)1.2預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的樣品用量），再加（20-x）mL甲醇混合，37℃水浴30分鐘后，測(cè)定A值（560nm）如：某樣品用量梯度為0（測(cè)出的值為A0值）、4、8、12、16、20mL，則加樣表如下：表1.加樣表樣品液甲醇PTIO試液總體積0mL20mL80mL100mL4mL16mL80mL100mL8mL12mL80mL100mL12mL8mL80mL100mL16mL4mL80mL100mL20mL0mL80mL100mL正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)用量需要測(cè)3個(gè)以上的平行數(shù)據(jù)，以避免誤差1.4數(shù)據(jù)處理PTIO自由基清除率的計(jì)算：清除率=（1-A/A0）*100清除率計(jì)算出來(lái)以后，可以做出量效關(guān)系的曲線，然后通過(guò)線性方程計(jì)算其樣品的IC50。1.5實(shí)例（槲皮素PTIO清除能力測(cè)定）首先，我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了合適的槲皮素樣品濃度（1mg/mL），及其用量，加樣表如下。表2.槲皮素(1mg/mL)加樣表槲皮素（mL）95乙醇（mL）PTIO試液(mL)總體積（mL）0208010021880100416801006148010081280100101080100同一個(gè)用量測(cè)定三組平行數(shù)據(jù)，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。表3.槲皮素吸光度槲皮素用量（mL）槲皮素實(shí)際吸光度（=槲皮素吸光度-空白對(duì)照組吸光度）平均吸光度00.3640.3640.3530.36020.2340.2370.2470.23940.1840.1980.1880.19060.1430.1360.1360.13880.1100.0970.1080.105100.0560.0630.0510.057然后，我們通過(guò)PTIO清除率的計(jì)算公式：清除率=（1-A/A0）*100，計(jì)算出槲皮素的清除率并作出量效曲線。如下圖表。表4.槲皮素相對(duì)清除率槲皮素用量（mL）槲皮素用量（mg/mL）相對(duì)清除率1相對(duì)清除率2相對(duì)清除率300///22035.0034.1731.3944048.8945.0047.7866060.2862.2262.2288069.4473.0670.001010084.4482.5085.83圖2.槲皮素的量效曲線及其線性方程（可用Excel軟件、Origin軟件作圖）通過(guò)其量效曲線及其線性方程，我們可以計(jì)算出槲皮素的IC50值，用以判斷槲皮素清除PTIO能力強(qiáng)弱。表5.槲皮素的IC50值LINKExcel.Sheet.12C:\\Users\\春酒\\Desktop\\有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)\\實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)\\曾婧媛\\槲皮素2019\\實(shí)驗(yàn)表格\\PTIO.xlsxSheet1!R24C26:R27C28\a\f5\hIC50ug/ml平均IC50ug/mlSD相對(duì)清除率143.9144.560.57相對(duì)清除率244.95相對(duì)清除率344.842.ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)[2]2.1溶液的配置ABTS儲(chǔ)備液（7.4mM）：取ABTS3mg，加蒸餾水1.48mL。K2S2O8儲(chǔ)備液（2.6mM）：取K2S2O82mg，加蒸餾水2.8mL。ABTS工作液：取ABTS儲(chǔ)備液0.2mL和K2S2O80.2mL，混合，在黑暗室溫環(huán)境內(nèi)放置12小時(shí)，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋10-20倍（也可以用95乙醇或甲醇），取80mL此溶液和20mL95乙醇混合，在734nm下測(cè)定吸光度，吸光度應(yīng)為0.30.01。樣品溶液：用合適溶劑溶解（一般為95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可適當(dāng)超聲使之完全溶解，混合均勻。2.2預(yù)實(shí)驗(yàn)基本與1.2預(yù)實(shí)驗(yàn)部分一樣，區(qū)別在于在734nm下測(cè)定吸光度。2.3A值測(cè)量基本操作與1.3A值測(cè)量部分一樣。但是PTIO試液換成ABTS工作液，甲醇換成ABTS工作液中用于稀釋的溶劑（如果用95乙醇稀釋?zhuān)@里加入的就是95乙醇），在734nm下測(cè)定吸光度。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)用量同樣是測(cè)定三個(gè)以上平行數(shù)據(jù)，以避免誤差。2.4數(shù)據(jù)處理ABTS自由基清除率=（1-A/A0）*100清除率計(jì)算出來(lái)以后，可以做出量效關(guān)系的曲線，然后通過(guò)線性方程計(jì)算其樣品的IC50。2.5實(shí)例（抗壞血酸）首先，我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了合適的抗壞血酸濃度（0.1mg/mL），及其用量，加樣表如下。表6.抗壞血酸（0.1mg/mL）加樣表抗壞血酸（mL）95乙醇（mL）PTIO試液(mL)總體積（mL）020801003178010061480100911801001288010015580100同一個(gè)用量測(cè)定三組平行數(shù)據(jù)，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。表7.抗壞血酸吸光度的測(cè)量結(jié)果抗壞血酸用量（mL）抗壞血酸實(shí)際吸光度（=抗壞血酸吸光度-空白對(duì)照組吸光度）平均吸光度12300.3120.3330.3290.32530.2430.2380.2460.24260.1850.1860.1760.18290.1360.1570.1280.140120.0540.0570.0460.052150.0070.0280.0060.014然后，我們通過(guò)ABTS清除率的計(jì)算公式：清除率=（1-A/A0）*100，計(jì)算出抗壞血酸的清除率并作出量效曲線。如下圖表。表8.抗壞血酸相對(duì)清除率抗壞血酸用量（mL）抗壞血酸用量（mg/mL）相對(duì)清除率1相對(duì)清除率2相對(duì)清除率300///3325.2326.7724.316643.0842.7845.859958.1551.6960.62121283.3882.4685.85151597.8591.3898.15圖3.抗壞血酸的量效曲線及其線性方程（可用Excel軟件、Origin軟件作圖）通過(guò)其量效曲線及其線性方程，我們可以計(jì)算出抗壞血酸的IC50值，用以判斷抗壞血酸清除ABTS自由基能力強(qiáng)弱表9.抗壞血酸的IC50值LINKExcel.Sheet.12C:\\Users\\春酒\\Desktop\\有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)\\實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)\\曾婧媛\\槲皮素2019\\實(shí)驗(yàn)表格\\PTIO.xlsxSheet1!R24C26:R27C28\a\f5\hIC50ug/ml平均IC50ug/mlSD相對(duì)清除率17.137.150.24相對(duì)清除率27.40相對(duì)清除率36.93【參考文獻(xiàn)】[1]XicanLi.2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide(PTIO?)Radical-scavenging:ANewandSimpleAntioxidant.JournalofAgricultural&FoodChemistry.2017，65,6288?6297；[2]XicanLi,TingtingWang,JingjingLiu,Yulon