抗原決定簇選擇課件

抗原決定簇的確立與選擇（一）抗原決定簇選擇報告內(nèi)容

概念

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研究意義2

研究方法3抗原決定簇選擇抗原表位--定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenicdeterminant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負責與抗體分子或免疫細胞表面的抗原受體結(jié)合。嚴格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的。抗原通過抗原表位與相應的淋巴細胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細胞，引起免疫應答；抗原也借表位與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應?？乖砦坏男再|(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)型決定抗原的特異性?？乖瓫Q定簇選擇抗原分子以其B細胞表位與抗體分子的抗原結(jié)合部位發(fā)生互補性結(jié)合A.抗原--抗體復合物的立體構(gòu)象；B.采用電腦技術(shù)將抗原和抗體分子分開，可見抗原和抗體分子的相互作用僅發(fā)生在抗原分子的B細胞表位和抗體分子的抗原結(jié)合部位之間，兩者呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)互補。C.抗體的互補決定區(qū)與抗原表位結(jié)合示意圖C抗原決定簇選擇一般情況下，一個多肽表位含5~6個氨基酸殘基；一個多糖表位含5~7個單糖；一個核酸半抗原的表位含6~8個核苷酸?？乖砦坏拇笮∨c相應抗體的抗原結(jié)合部位相適合。一個抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定，但其中有些殘基在與抗體結(jié)合時比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團。

抗原決定簇選擇抗原表位--分類覆蓋型和非覆蓋型表位

某些抗原分子表面，不同表位之間相對分離，各自結(jié)合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。若某一表位與相應抗體結(jié)合會影響另一表位與抗體的結(jié)合，此類表位稱為覆蓋型表位。

功能性和隱蔽表位

位于抗原分子表面的表位易被相應淋巴細胞所識別，即具有易接近性，可直接啟動免疫應答，故稱為功能性表位。存在于抗原分子內(nèi)部的表位無直接觸發(fā)免疫應答的功能，稱為隱蔽表位。若通過理化因素處理抗原，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部的隱蔽表位被暴露，可能成為新的有功能的表位。

抗原決定簇選擇按表位結(jié)構(gòu)不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位。連續(xù)性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成通常這種結(jié)合比較弱，因為小肽并不含完整天然蛋白的構(gòu)象，在多數(shù)情況下這種表位可能只代表了復雜表位的一部分。對其研究依賴于多肽固相化學合成技術(shù)。后者又稱構(gòu)象型抗原表位，是由那些空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成。

分類抗原決定簇選擇

按照與抗原受體細胞結(jié)合不同，分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。分類特性T細胞表位B細胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無需表位性質(zhì)主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有機化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個氨基酸，5-7個單糖或5-7個核苷酸表位類型線性表位構(gòu)象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面抗原決定簇選擇研究意義表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎，研究蛋白質(zhì)抗原表位，對于設計具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特異性診斷試劑盒中更為重要?？乖瓫Q定簇選擇抗原表位研究方法通過化學或生物學方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起陽性反應的片段。1.1用化學法或酶“切割”抗原，分離抗原肽段該法對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)不作要求，但測定結(jié)果只能是抗原的線性表位?；瘜W切割法中常用的試劑：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8蛋白酶等。水解后采用各種分離方法如SDS-PAGE、凝膠過濾、離子交換將水解片段分開，然后用Westernblot，ELISA等各種檢測手段來檢測。結(jié)果可通過理論肽段分子量的推斷或相應的氨基酸序列分析來判斷。利用該法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌細胞增強蛋白、乙酰膽堿酯酶、玻璃體結(jié)合蛋白、磷脂酶基質(zhì)蛋白等。1.傳統(tǒng)化學“切割”法或酶法（classicalepitopemapping）抗原決定簇選擇研究方法1.2水解抗原-抗體復合物這是一個直接的確定線性及構(gòu)象性抗原表位的方法，又稱為Proteinfootprinting。其理論依據(jù)為抗原--抗體復合物的結(jié)合部位能抵抗蛋白酶的水解。根據(jù)蛋白質(zhì)抗原性質(zhì)的不同常采用3種方法。對于蛋白酶水解位點較少的抗原，一般先將抗原與等摩爾抗體在PBS中反應，然后酶解，SDS分離水解產(chǎn)物，分析結(jié)果。對于蛋白酶水解位點較多的抗原，采用HPLC法，將抗原--抗體復合物的酶解片段和同樣條件下的抗原酶解片段分別用HPLC分析。兩者圖譜對應峰峰高比大于平均數(shù)值的片段則推測為抗原表位。對于能確定為線性表位的抗原可先將抗體連接于固相載體上，并將此固相載體裝柱，然后讓過量的抗原溶液通過此柱，使抗原-抗體形成復合物。一定條件下，酶溶液過柱，酶解此抗原-抗體復合物，PBS洗去酶解下的不結(jié)合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下與抗體結(jié)合的肽段。HPLC分析這些片段以確定結(jié)果。近來，質(zhì)譜技術(shù)在這類結(jié)果分析中得到了廣泛的應用。采用該法已成功地確定了細胞色素C，胃泌素釋放肽(GRP)，脂堿性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位?？乖瓫Q定簇選擇2.合成肽庫方法有機合成法就是直接利用固相肽合成技術(shù)，合成含有各種可能序列的短肽。通過這種合成可以保證各種序列的多肽等機率出現(xiàn)，每個載體上只含有一種序列的短肽。優(yōu)點是構(gòu)建方法簡單，迅速。缺點是不能擴增，篩選比較麻煩，需進行熒光標記或ELISA，在顯微鏡下操作工作量比較大。在研究構(gòu)象性表位時的minotopes方法即采用類似的方法，通常從二肽開始合成并逐漸增加肽鏈長度及置換氨基酸種類，直至達到與抗體的最大結(jié)合為止。研究方法2.1有機合成法肽庫是大量某一長度(如六肽)的短肽的集合，它包括了該長度的短肽的各種可能序列或其中的絕大部分?？乖瓫Q定簇選擇該法先利用基因克隆技術(shù)將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達。再利用生物素或酶標記的抗體篩出特異的噬菌體，并進行擴增，再篩選，從結(jié)合特異抗體的噬菌體DNA序列推斷出氨基酸序列，并合成相應的短肽，驗證篩選結(jié)果。用此法檢測的抗原表位有人H鐵蛋白、藍舌病病毒的外殼蛋白VP5等。研究方法2.2

基因工程法（噬菌體隨機肽篩選法）抗原決定簇選擇此技術(shù)于1992年由R.Frank發(fā)展出來，它主要是將涵蓋所有抗原氨基酸序列的縮氨酸合成于固定的表面，并與抗血清標定，此法可鑒定線性抗原表位。應用肽合成技術(shù)合成連續(xù)的重疊的5～7肽，將這些合成的肽與相應的抗體反應，分析檢測結(jié)果，以確定陽性反應片段。這一技術(shù)要求有明確的抗原的一級結(jié)構(gòu)，并且檢測結(jié)果為抗原線性表位。該法應用廣泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生蟲蛋白、煙草花葉病毒(TMV)、Fy6蛋白、鴨肝炎B病毒(DHBV)等。

3縮氨酸掃描技術(shù)(PeptideScantechnology)研究方法抗原決定簇選擇4表位作圖早期表位作圖或定位(epitopemapping)是基于蛋白質(zhì)修飾和降解的原理，可經(jīng)側(cè)鏈化學修飾法選擇性地標記氨基酸，失去結(jié)合的部分將被測出。蛋白質(zhì)抗原被降解為小片段，經(jīng)測序后確定抗體結(jié)合的位點。要確定某一抗原的全部表位需要大量的時間。現(xiàn)已可以通過誘變、蛋白質(zhì)合成或蛋白競爭結(jié)合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應用對抗體結(jié)合表位的分析具有顯著的優(yōu)越性。研究方法抗原決定簇選擇研究方法--表位作圖方法構(gòu)象表位線性表位條件精確度競爭分析方法是，但并非經(jīng)常是標記抗體、抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達法是，但并非經(jīng)常是必須克隆，DNA(已知基因序列)構(gòu)象50-200個氨基酸線狀10-20個氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫完全繪制3-15推薦使用表位作圖方法和基本條件抗原決定簇選擇研究方法從80年代Hopp和Woods提出親水性參數(shù)對抗原表位預測的方法以來，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，對B細胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動作用?，F(xiàn)已被大眾認可并具有較好預測效果的方法，主要有以下6種：5抗原表位的預測法抗原決定簇選擇(1)親水性方案(Hydrophilicity)

Nozaki-Tanfordscale，Eisenberg

scale，Kyte-Doolittle

scale，HPLC

scale，Hopp-WoodsscaleHopp-Woods方案認為：蛋白質(zhì)抗原的氨基酸殘基可分為疏水性和親水性兩類。在機體內(nèi)，疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系。Hopp-Woods方案是以殘基由有機相環(huán)境轉(zhuǎn)移到水相環(huán)境的自由能為依據(jù)計算各個氨基酸的親水性。現(xiàn)已明確，親水性部位與抗原表位并無很好的一致性，即高親水性部位不一定是表位，表位也不一定是親水性部位?？乖砦坏念A測法抗原決定簇選擇(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性參數(shù)，指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性。它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。B細胞抗原表位的預測法抗原決定簇選擇(3)抗原性方案(Antigenicity)對20個已研究得很透的蛋白質(zhì)的69個連續(xù)位點的606個氨基酸統(tǒng)計分析，Welling建立了抗原性刻度。每個氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)的頻率描述，此頻率除以各氨基酸在所有蛋白質(zhì)中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明，疏水性氨基酸殘基對抗原表位形成亦有貢獻。缺點是其所用的數(shù)據(jù)庫有限，并且連續(xù)位點內(nèi)的殘基被認為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計算會明顯降低相關(guān)性?？乖砦坏念A測法抗原決定簇選擇(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動性，活動性強的氨基酸殘基即可塑性大的位點，易形成抗原表位。Karplas和Schulz基于已知結(jié)構(gòu)的31個蛋白質(zhì)，發(fā)展了一種預測蛋白質(zhì)片段活動性的方法。(5)電荷分布方案(Chargedistribution)認為對堿性抗原特異的抗體多趨于酸性，對酸性抗原特異的抗體多趨于堿性。抗原表位的預測法抗原決定簇選擇(6)二級結(jié)構(gòu)預測方案(Secondarystructure)認為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。而α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，較難嵌和抗體，一般不作為抗原表位。可預測蛋白質(zhì)β轉(zhuǎn)角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各種方法預測的成功率均不超過65%。一般認為Cohen方法對轉(zhuǎn)角的預測正確率很高，對于已知折疊類型的蛋白質(zhì)(αα類，ββ類，α/β類)正確率高達95%，對于未知結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)，可用3種類型分別預測，3類預測一致的轉(zhuǎn)角對預測表位有幫助?？乖砦坏念A測法抗原決定簇選擇對上述各種參數(shù)的預測比較表明，各種方案預測的正確率均不高。一般將上述多種方案綜合考慮，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二級結(jié)構(gòu)預測為重要。已經(jīng)有一些文獻提出了各自不同的綜合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一種綜合預測方案。權(quán)重選擇為：40%來自二級結(jié)構(gòu)成分，可及性、柔韌性各15%，30%來自親水性。在吳加金等編的Goldkey軟件中，以六種參數(shù)Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，F(xiàn)lexibility，Charge，Antigenivity綜合考慮，得出綜合判斷圖，閾值以上的峰即認為是預測的抗原表位。從軟件預測出的抗原表位須用實驗來進一步驗證?？乖砦坏念A測法抗原決定簇選擇以往合成的序列肽僅模擬蛋白質(zhì)的線性表位，這無疑會遺漏眾多的構(gòu)象性表位信息。近些年來,隨著生物信息學和分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，采用計算機預測和試驗相結(jié)合的方法進行構(gòu)象性表位分析和定位得到了迅速發(fā)展，一些可用的基于Web的預測軟件已經(jīng)公布，如CEP軟件、DiscTope軟件和MEPS軟件。應用噬菌體展示肽庫技術(shù)結(jié)合計算機建模進行構(gòu)象性表位預測是另一類預測B細胞構(gòu)象性表位的方法。即利用抗體篩選噬菌體肽庫，獲取抗體親和性模擬肽，對模擬肽集合進行比對處理，獲得探針基序，然后利用探針基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，獲得的序列即作為預測結(jié)果。1990年Scott首次將噬菌體隨機肽庫技術(shù)應用于抗原定位。目前提供的基于Web的預測服務算法有Pepitope算法、3DEX算法和