藥品生物檢定技術(shù)復(fù)習(xí)課件

第一章供試品溶液的配置1、藥品生物檢定的概念及“特殊反響〞例子2、標(biāo)準(zhǔn)品分類(lèi)3、藥品生物檢定的任務(wù)4、供試品的配置生物檢定〔Bioassay〕是利用生物體對(duì)藥品的特殊反響來(lái)測(cè)定藥品的有效性、平安性和研究藥物量效關(guān)系?！疤厥夥错懆?--量反響，質(zhì)反響------微生物致死反響測(cè)定抗生素------小鼠熱板法測(cè)定鎮(zhèn)痛藥標(biāo)準(zhǔn)品分為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，工作標(biāo)準(zhǔn)品如：聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織生物檢定委員會(huì)，丹麥哥本哈根血清所，倫敦國(guó)家醫(yī)研所2006年5月4日起EDQM〔歐洲藥品質(zhì)量管理局〕將取代英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所〔NIBSC〕的職能，負(fù)責(zé)WHO抗生素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的建立、貯藏與分發(fā)。中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品統(tǒng)一由國(guó)家藥品生物制品檢定所管理。工作標(biāo)準(zhǔn)品由個(gè)企業(yè)自行按需要制備。藥品生物檢定的任務(wù)藥品效價(jià)測(cè)定---第六、十二、十三章有害物質(zhì)檢查---第十、十一、十四章微生物限度檢查---第四、八章無(wú)菌檢查---第五章配置操作的本卷須知配置實(shí)驗(yàn)器具的滅菌與消毒固體稱(chēng)量的本卷須知注意點(diǎn)容量瓶定容的本卷須知檢查容量瓶的密閉性吸管的預(yù)洗移液管尾滴的處理

第六章抗生素效價(jià)的

微生物測(cè)定１.解釋抗生素概念、了解抗生素的主要作用機(jī)制

２.表達(dá)抗生素的效價(jià)和單位及其表示方法

３.熟知抗生素效價(jià)檢定操作流程與根本要求

４.測(cè)定原理。第一節(jié)概述一、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所產(chǎn)生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制它種生物或腫瘤、細(xì)胞生長(zhǎng)的一類(lèi)天然有機(jī)化合物。二、醫(yī)藥用抗生素的特點(diǎn)具備以下4個(gè)特點(diǎn)才能應(yīng)用到臨床。(1)有較大的差異毒力

是由抗生素的作用機(jī)制決定的,如青霉素類(lèi)抗生素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，而對(duì)人與哺乳動(dòng)物沒(méi)有影響,因而該類(lèi)抗生素具有明顯的差異毒力。(2)抗菌活性強(qiáng)

抗菌活性的強(qiáng)弱常用最低抑菌濃度(MIC)來(lái)衡量，MIC值越小，表示活性越強(qiáng)。

(3)抗菌譜廣即指各種抗生素所能抑制或殺滅微生物的范圍，范圍廣譜者稱(chēng)為廣譜抗生素，即對(duì)多種病原菌都有抑制和殺滅作用；范圍窄的為窄譜抗生素，如青霉素主要抑制革蘭陽(yáng)性菌，多粘菌素只能抑制革蘭陰性菌，而具有抗腫癌作用的抗生素那么稱(chēng)為抗腫瘤抗生素。(4)不產(chǎn)生副作用和不良反響良好的抗生素應(yīng)對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，不引起變態(tài)反響，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性?！惨弧掣攀鑫锢怼⒒瘜W(xué)法微生物法簡(jiǎn)便、快速，本身純度不高，采用該法會(huì)引起偏差，因此只有在純度較高情況下可采用原理和臨床應(yīng)用的要求相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高，需用量較小，因此被廣泛使用。微生物法依據(jù)抗生素最小抑菌濃度而設(shè)計(jì)的稀釋法；根據(jù)不同濃度的抗生素對(duì)微生物生長(zhǎng)速度的不同影響程度而設(shè)計(jì)的比濁法[?中國(guó)藥典?稱(chēng)之為濁度法并收載]；有依據(jù)抗生素滲透到含敏感菌的瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌圈而設(shè)計(jì)的管碟法(又稱(chēng)擴(kuò)散法，杯碟法或垂直擴(kuò)散法)；根據(jù)對(duì)微生物呼吸抑制程度而設(shè)計(jì)的呼吸度量法；根據(jù)對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的影響而設(shè)計(jì)的快速法，對(duì)微生物體內(nèi)酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響的脫氫法。濁度法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的種方法。管碟法：是利用抗生素在含敏感試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基中的球面擴(kuò)散滲透作用，從而形成一定的抑菌圈。通過(guò)瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測(cè)量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的外表積或直徑成正比〔二〕抑菌圈的形成

將不銹鋼小管(俗稱(chēng)為牛津杯)放置在含敏感試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基置入適宜試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)箱中，瓊脂培養(yǎng)基中的試驗(yàn)菌開(kāi)始生長(zhǎng)?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開(kāi)小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管愈遠(yuǎn)，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素分子愈少，相應(yīng)的抗生素濃度愈低。當(dāng)抗生素分子擴(kuò)散到一定時(shí)間，在小鋼管周?chē)纬梢粋€(gè)能有效的抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的范圍，也就是通常所說(shuō)的抑菌圈?？股厝芤旱臐舛炔煌?，抑菌圈的大小亦不同(圖4－1)。按設(shè)計(jì)原理不同分

管碟法一劑量法〔標(biāo)準(zhǔn)曲線法〕二劑量法〔2·2法〕三劑量法〔3·3法〕管碟法分為三種方法一劑量法又稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，常用于原料生產(chǎn)的過(guò)程監(jiān)控、中間體或半成品檢驗(yàn)；二劑量法是抗生素質(zhì)量檢驗(yàn)的常規(guī)方法；三劑量法主要用于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定。中國(guó)獸藥典〔2005年版〕收載了二劑量法和三劑量法。第二節(jié)

抗生素的效價(jià)和單位

一、抗生素的效價(jià)和單位抗生素的含量用效價(jià)和單位表示。該詞有時(shí)不加區(qū)別統(tǒng)稱(chēng)為效價(jià)單位。效價(jià)〔ｐotency〕－指檢品的實(shí)際單位數(shù)與其標(biāo)示量的比值。常表示為效價(jià)的百分?jǐn)?shù)。效價(jià)是從比較檢品與標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性而得。在不同的微生物效價(jià)測(cè)定中，效價(jià)計(jì)算的公式見(jiàn)后述。單位〔unit,u〕單位是衡量抗生素有效成分的具體尺度。各種抗生素的單位含義不同，在習(xí)慣上根據(jù)它們的實(shí)際開(kāi)展情況而定，抗生素效價(jià)單位的具體表示方法見(jiàn)后述。標(biāo)準(zhǔn)品與國(guó)際單位(internationalunit,iu)抗生素微生物測(cè)定用的標(biāo)準(zhǔn)品，除國(guó)內(nèi)的新品種外，凡已制備國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的品種，在制備國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，均與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品比較而定出效價(jià)。

二、抗生素的效價(jià)單位的表示方法１、質(zhì)量單位以抗生素的生物活性局部質(zhì)量作單位，１微克〔ｕｇ〕＝１單位，１毫克＝１０００單位。２、類(lèi)似質(zhì)量單位以特定的純粹抗生素鹽類(lèi)的質(zhì)量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽〔包括無(wú)生物活性的鹽酸根在內(nèi)〕１微克〔ｕｇ〕＝１單位，１毫克＝１０００個(gè)單位。這是根據(jù)國(guó)際使用習(xí)慣而來(lái)的。３、質(zhì)量折算單位以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。４、特定單位以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量定為一單位。第三節(jié)

管碟法測(cè)定操作1.試驗(yàn)用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基的制備按藥典規(guī)定進(jìn)行制備。2.標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備按藥典規(guī)定制備標(biāo)準(zhǔn)品與供試品上下不同濃度溶液。(見(jiàn)表4-3和4-11)。3.雙碟的制備制備底層及含一定量試驗(yàn)菌的菌層，并安置小鋼管。4.滴加藥液到小鋼管內(nèi)將標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液滴入相應(yīng)的小鋼管中。5.培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。6.測(cè)量抑菌圈可用手工測(cè)量或儀器測(cè)量。7.計(jì)算結(jié)果先進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn),符合規(guī)定,再進(jìn)行效價(jià)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的稱(chēng)量

→標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋→標(biāo)準(zhǔn)品溶液

供試品的稱(chēng)量

→供試品的稀釋→供試品溶液

緩沖液的制備

培養(yǎng)基的制備→

底層20ml─→菌層5ml─→┌───平板的制備────┐

凝固后

凝固后

↓

↓

菌液的制備

加菌液

加小鋼管--─┐─┐可靠性測(cè)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果

←──測(cè)量抑菌圈←─培

養(yǎng)

抗生素效價(jià)檢定管碟法操作流程第三節(jié)

管碟法測(cè)定操作加陶瓦園蓋T2S1S2T1二劑量法擴(kuò)散現(xiàn)象：由球面擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)公式表示相當(dāng)于直線方程：y=bX+c抗生素總量的對(duì)數(shù)值與所形成抑菌圈直徑的大小呈直線關(guān)系，來(lái)測(cè)定抗生素抗菌活性。1理論依據(jù)：2.影響因素?

Ⅰ超凈工作臺(tái)Ⅲ雙碟Ⅱ抑菌圈測(cè)量?jī)xⅤ鋼管Ⅳ陶瓦蓋Ⅵ恒溫培養(yǎng)箱Ⅷ玻璃儀器Ⅸ游標(biāo)卡尺Ⅹ緩沖液Ⅺ培養(yǎng)基Ⅻ試驗(yàn)菌Ⅶ滅菌刻度吸管3.儀器用具材料抑菌圈〔抗生素效價(jià)〕自動(dòng)測(cè)量分析儀③菌懸液的制備⑦檢定法④標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備⑤供試品溶液的制備⑥雙碟的制備②滅菌緩沖溶液①培養(yǎng)基及其制備方法4.測(cè)定方法水1000ml磷酸二氫鉀1.32g

磷酸氫二鉀3.68g氯化鈉3.sg酵母浸出粉3g

胨5g牛肉浸出粉1.5g葡萄糖1g培養(yǎng)基3號(hào)①培養(yǎng)基及其制備方法除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)P值使滅菌后為7．0～7．2，在115oC滅菌3分鐘，即得。磷酸鹽緩沖液〔PH6.0〕取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過(guò)，在115oC滅菌30分鐘，即得。磷酸鹽緩沖液〔pH7.8〕取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過(guò)，在115oC滅菌30分鐘，即得。②滅菌緩沖液枯草芽抱桿菌懸液取枯草芽抱桿菌〔63501〕的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有普通瓊脂斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35－37oC培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85％以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65oC加熱30分鐘，即得。短小芽抱桿菌懸液取短小芽抱桿菌〔63202〕的普通瓊脂料面培養(yǎng)物，照上述方法制備，即得。③菌懸液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)的規(guī)定。臨用時(shí)照附表的規(guī)定進(jìn)行稀釋。

精密稱(chēng)〔或量〕取供試品適量，用各該藥品項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量照附表的規(guī)定稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛取＂軜?biāo)準(zhǔn)品溶液的制備⑤供試品溶液的制備

取內(nèi)徑90mm、高16—17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48－50oC〔芽孢可至60℃〕，參加規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量〔能得清晰的抑菌圈為度。二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18－24mm。⑥雙碟的制備二劑量法取照上述方法制備的雙碟不得少于4個(gè)，在每1雙碟中對(duì)角的2個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余2個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的上下兩種濃度的供試品溶液，高、低濃度的劑距為2：1或4：1。在規(guī)定條件下培養(yǎng)后，測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑〔或面積〕。⑦檢定法供試品效價(jià)相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)=㏒-1[T1＋T2－S1－S2×I]×100T2＋S2－T1－S1⑧統(tǒng)計(jì)計(jì)算與結(jié)果判定S2=高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的各抑菌圈直徑的總和，S1=低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的各抑菌圈直徑的總和，T2=高濃度供試品溶液所致的各抑菌圈直徑的總和，T1=低濃度供試品溶液所致的各抑菌圈直徑的總和。I=高濃度與低濃度比值的對(duì)數(shù)。將此百分?jǐn)?shù)乘以供試品估計(jì)效價(jià)的毫克單位數(shù)，即得供試品每lmg中所含的單位數(shù)。二、影響因素的控制1．直線斜率的控制斜率小，即抗生素濃度差異小，而抑菌圈的直徑差異大，靈敏度的準(zhǔn)確性高。2．直線截距的控制直線截距決定于C、D、T、H諸因素，其中D、T值一般相當(dāng)穩(wěn)定，所以C、H是決定截距的主要因素。如將培養(yǎng)基厚度H減小，截距也隨之減小，抑菌圈增大。據(jù)此可設(shè)計(jì)薄層培養(yǎng)基，可大大提高檢驗(yàn)的靈敏度

3．抑菌圈大小的控制抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及A等諸因素的影響?？股乜偭縈＝CV＝CAL，〔A為管底面積、L為高度、V為管內(nèi)體積、C為抗生素濃度〕,可見(jiàn)抗生素濃度是影響抑菌圈大小的，假設(shè)C不變，那么r2隨V而變化，那么L或A均影響抑菌圈大小。因此抗生素濃度應(yīng)準(zhǔn)確，包括稱(chēng)量、稀釋均應(yīng)準(zhǔn)確，稀釋用的儀器、容器均應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。4．培養(yǎng)基的厚度H、試驗(yàn)菌敏感度C、擴(kuò)散系數(shù)D的影響

H增大，r縮小；H減小，r增大。C常受加菌量及對(duì)抗生素耐藥性等因素的影響而有所改變，從而影響r大小。T受細(xì)菌生長(zhǎng)快慢的影響而引起r改變。D擴(kuò)散快慢亦可使r改變，因此應(yīng)注意選用敏感性的試驗(yàn)菌并保持其不變異，特別要防止染菌，制備菌層時(shí)含菌濃度要適宜，可采用預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定；向小鋼管內(nèi)滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液時(shí)要交叉進(jìn)行，以免偏向。

5.劑量反響直線范圍控制直線范圍在以下情況下會(huì)縮短：管徑小、裝量??；濃度低；因培養(yǎng)基或試驗(yàn)菌吸附或破壞抗生素等因素使小鋼管中抗生素量下降，導(dǎo)致直線范圍縮短，常使呈弧形。為此可用調(diào)整緩沖液的pH值，使抗生素穩(wěn)定；調(diào)整培養(yǎng)基pH值；調(diào)整培養(yǎng)基的處方及除去雜質(zhì)；選用更為敏感的試驗(yàn)菌加以控制。6.抑菌圈圓整及清晰度的控制抑菌圈常有破裂不圓，甚至無(wú)圈現(xiàn)象。這些情況的產(chǎn)生主要是由于向小鋼管加抗生素溶液時(shí)有濺出或漏出；有時(shí)也可能因雙碟或小鋼管殘留或污染有抗生素而造成的。如果污染雜菌或因菌層培養(yǎng)基溫度過(guò)高，試驗(yàn)菌被燙死，均會(huì)使抑菌圈不圓整或破裂。(2)抗生素的培養(yǎng)基內(nèi)抗散系數(shù)不一所引起抗生素的培養(yǎng)基內(nèi)抗散系數(shù)不一，如混有幾種類(lèi)型的抗生素、抗生素受緩沖液或受培養(yǎng)基內(nèi)的雜質(zhì)影響，或使其形成某種化合物，致使抗生素濃度總量發(fā)生變化。因此對(duì)培養(yǎng)基的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等的選用極為重要。這些都可影響仰菌圈的大小和清晰度。在某些情況下出現(xiàn)抑菌圈邊緣模糊、類(lèi)似鋸齒狀或雙圈等現(xiàn)象，主要由以下因素所引起：

(1)試驗(yàn)菌培養(yǎng)物不純所引起當(dāng)試驗(yàn)菌培養(yǎng)物不純，幾種菌株，如菌種中雜有耐藥性菌，使C含有C，、C，，、C，，，等差異含有一同敏感度的，致使擴(kuò)散系數(shù)紊亂。其次菌種中有不同生產(chǎn)時(shí)間的菌體，以致有不同的Ｔ值，這些都能使抑菌圈邊緣不清晰。(3)小鋼管內(nèi)的抗生素濃度不斷下降所引起當(dāng)試驗(yàn)菌能吸附或破壞抗生素時(shí)，這種情況就更加嚴(yán)重，此時(shí)可出現(xiàn)雙圈現(xiàn)象。

(4)不適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間所引起由于某些抗生素的抑菌圈邊緣的菌群只是被抑制，當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低。抑菌圈邊緣菌群繼續(xù)繁殖，導(dǎo)致抑菌圈變小或邊緣模糊不清不整齊，如測(cè)定制霉菌素時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，其抑菌圈邊緣就不清晰或不整齊。要控制培養(yǎng)時(shí)限，使抗生素培養(yǎng)基的濃度，恰當(dāng)抑制實(shí)驗(yàn)菌，而在抑菌圈邊緣的濃度能刺激試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，就能形成清晰的抑菌圈。此外，對(duì)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品同質(zhì)的要求至為重要。因?yàn)樾r(jià)測(cè)定設(shè)計(jì)是假定二者劑量反響直線是相互平行除操作影響外，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)品中或供試品中假設(shè)有其他抗菌性物質(zhì)或影響抗菌活性的物質(zhì)〔加強(qiáng)或拮抗〕，均可使二者劑量反響直線不平行，對(duì)此必須注意。如供試品四環(huán)素制劑中含有維生素C時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)品中也應(yīng)參加相應(yīng)的維生素C，以保持標(biāo)準(zhǔn)品供試品的同質(zhì)性，這樣檢驗(yàn)結(jié)果才是可行的，也才能準(zhǔn)確。三、抗生素操作要求〔1〕防止抗生素污染由于管碟法是微量的微生物分析法，故稱(chēng)量稀釋除應(yīng)滿(mǎn)足用容量分析及儀器分析進(jìn)行定量分析的一般要求外，還應(yīng)注意效價(jià)測(cè)定試驗(yàn)室內(nèi)防止抗生素污染。效價(jià)測(cè)定滴加鋼管的操作室內(nèi)，地面，水平操作臺(tái)，鋼管放置器，鋼管，墻壁以及各項(xiàng)玻璃用具，工作服，工作人員雙手等，都要防止被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使試驗(yàn)結(jié)果混亂。微量的抗生素還可以附著在塵埃上，隨著空氣流動(dòng)散落在雙碟培養(yǎng)基平板，鋼管，鋼管放置器上，有時(shí)可能是使抑菌圈破裂的原因。因此，要防止將抗生素溶液滴在地上或工作臺(tái)上，如被污染時(shí)應(yīng)及時(shí)清潔。在配制培養(yǎng)基或緩沖液時(shí)，亦應(yīng)嚴(yán)防被抗生素污染?！?〕操作次數(shù)序安排上的誤差在一劑量法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，雙碟數(shù)量較多，滴加抗生素溶液至鋼管的時(shí)間，各個(gè)雙碟的時(shí)間根本一致。如滴加8組稀釋度雙碟，可從中心濃度組開(kāi)始向高，低二端交叉滴加。如稀釋度為C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7及C8，滴加次序可C4，C5，C3，C6，C2，C7，C1及C8。這樣，可減少各組間抗生素?cái)U(kuò)散時(shí)間及試驗(yàn)菌生長(zhǎng)時(shí)間的差異。尤以枯草桿菌在室溫較高時(shí)，這種影響更為明顯。此外，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱(chēng)量，應(yīng)在相近的時(shí)間內(nèi)稱(chēng)取，稀釋后的溶液盡量在相同的條件下放置，并使放置的時(shí)間也相同，以減少誤差。三劑量法

所謂三劑量法是指用高、中、低三種劑量，在同一條件下比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液產(chǎn)生的抑菌圈大小，以求得供試品效價(jià)的方法。三劑量比二劑量多一種抗生素劑量，能增加結(jié)果的準(zhǔn)確程度。在選用三劑量法時(shí)，要求劑量的大小一定要在直線關(guān)系的范圍內(nèi)。在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確效價(jià)時(shí)通常選用三劑量法.一、效價(jià)計(jì)算公式PT=lg-1[0.1292(T3+T2+T1-S3-S2-S1)/(S3+T3-S1-T1)]×100％(4－10)二、測(cè)定方法按?中國(guó)藥典?(2005年版)規(guī)定制備試驗(yàn)菌懸液，培養(yǎng)基，并配制抗生素標(biāo)準(zhǔn)品及檢品的高、中、低三種劑量的溶液，三種溶液的劑距為1:0.8，標(biāo)準(zhǔn)品中劑量的抑菌圈直徑為15～18mm。選用的雙碟不得少于6個(gè)，在每一雙碟中間隔的3個(gè)不銹鋼小管中分別滴加高濃度、中濃度、及低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)小鋼管中分別滴加相應(yīng)的高、中、低三種濃度的供試品溶液。經(jīng)培養(yǎng)后，精密量取各抑菌圈直徑，經(jīng)可靠性測(cè)定后，符合規(guī)定，按效價(jià)計(jì)算公式計(jì)算效價(jià)。如不符合規(guī)定，予以重試。三、效價(jià)計(jì)算和誤差分析可參考?中國(guó)藥典?(2005年版)附錄內(nèi)容的例題。一劑量法一、設(shè)計(jì)原理與計(jì)算公式本法系用效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在同樣條件下測(cè)出供試品溶液所致抑菌圈直徑的平均值后，再求出其與標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致抑菌圈直徑平均值之差，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接得供試品溶液的濃度，換算出效價(jià)，故稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。由于檢定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品都采用一個(gè)劑量，故也稱(chēng)一劑量法。由公式(4－2)：lgM=(1/9.21DT)r2＋lg(C.4πDTH)可知，抗生素總量的多少受最低抑菌濃度(C)培養(yǎng)基厚度(H)擴(kuò)散系數(shù)(D)和細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間的影響；同時(shí)由公式(4－1)r2=4DT［lnM-lnC-ln(4πDTH)］也可看出抑菌圈的大小也受C，H，D，T的影響。所以在效價(jià)測(cè)定時(shí)應(yīng)消除這些影響，才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。消除這些影響，可用相對(duì)效價(jià)設(shè)計(jì)法，即用標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)作對(duì)照測(cè)定的方法。其計(jì)算方法如下：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈直徑為S1：標(biāo)準(zhǔn)品的總量為M。供試品的抑菌圈直徑為T(mén)1:供試品的總量為M’。那么lgM=(1/9.21DT)S21+lg(C.4πDTH)(4－11)lgM’=(1/9.21DT)T21+lg(C.4πDTH)(4－12)因lg(C.4DTH)為截距，在同一雙碟上其數(shù)值是相等的，因此兩式相減時(shí)可以消掉并得到lgM’/M=(1/9.21DT)(T21-S21)(4－13)lgM’/M為供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比對(duì)數(shù)，令θ=M’/M那么：lgθ=(1/9.21DT)(T21-S21)(4－14)因(1/9.21DT)直線的斜率，故供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比對(duì)數(shù)即等于斜率乘供品的抑菌圈直徑的平方與標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈直平方之差。此即管碟法的標(biāo)準(zhǔn)曲線法的根底。根據(jù)上述原理?？芍r(jià)與抑菌圈半徑的(或直徑的)平方成直線關(guān)系，其直線方程式為lgY＝aX＋b。當(dāng)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照測(cè)定時(shí)，b可消掉，成為lgθ＝a〔X，－X〕，也即效價(jià)的對(duì)數(shù)等于斜率供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈直徑之差數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定效價(jià)便以根底。即:lg效價(jià)=(斜率)×(供試品抑菌直徑-標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈直徑)(4－15)在上式中只要知道斜率，那么可求出lg效價(jià)。為了消除測(cè)定碟間的差異，在每一雙碟的加菌培養(yǎng)基上置6枚不銹鋼小管〔簡(jiǎn)稱(chēng)小鋼管〕，間隔的3枚內(nèi)中參加標(biāo)準(zhǔn)品的某一特定濃度Ck，它們所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為，另3枚內(nèi)參加標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度Co，它們所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為0。令fk=yk－y0(4－16)這樣采用的自身對(duì)照方法，當(dāng)某一碟的條件使抑菌圈偏大時(shí)，k和0都將按相似的程度偏大，反之亦然。因此fk在碟間的差異必然小于k在碟間的差異。所以f值亦應(yīng)與抗生素濃度的對(duì)數(shù)值呈直線的函數(shù)關(guān)系。即f=ax+b，據(jù)此可只制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、標(biāo)準(zhǔn)曲線制定與測(cè)定方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制定①中心濃度的選擇：根據(jù)各種抗生素的對(duì)數(shù)濃度〔劑量〕一抑菌圈〔反響〕拉關(guān)系的直線范圍內(nèi)，先選擇一個(gè)中心濃度Co，濃度所致的抑菌直徑大小適合在16～17.5mm，并用容量瓶稀釋制備溶液。一般均取整數(shù)。②各劑量按等比級(jí)數(shù)稀釋?zhuān)瑒┚嘁话銥槿N：1：0.81：0.881：0.85。當(dāng)中心濃度和劑距確定了以后，應(yīng)再算出中心劑量鄰近的上下2個(gè)濃度C0+1及C0-1。例如：Co=10u/ml，劑距ｒ?yàn)?:0.8；∵r=(C0+1)/(C0-1)=1/0.8，∴C0-1=0.8(C0+1)。又C0+1/C0=C0/C0-1，∴C0+1=10--2/C0～1，經(jīng)推導(dǎo)，C0-1=8.94U/mlC0+1=11.18U/ml，其它各量按等比級(jí)數(shù)分別計(jì)算即得。③從試驗(yàn)結(jié)果求得各點(diǎn)位置，在半對(duì)數(shù)座標(biāo)紙上，將各點(diǎn)連接得一直線，直線應(yīng)通過(guò)中心點(diǎn)，由各劑距量點(diǎn)連成的標(biāo)準(zhǔn)直線應(yīng)有70％的點(diǎn)在直線上。④試驗(yàn)器材準(zhǔn)備及操作見(jiàn)本章第四節(jié)?，F(xiàn)以鏈霉素效價(jià)測(cè)定為例加以說(shuō)明如下：精密稱(chēng)取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖液稀釋成各種濃度Ck(k1-K8)，見(jiàn)表4－6。同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)品中心濃度C01.0U/ml，劑間比1:0.88，取備妥的雙碟24只，分為8組每組3只。每組各碟內(nèi)間隔的3枚小鋼管內(nèi)分別滴滿(mǎn)標(biāo)準(zhǔn)品Ｃk1-8，即0.64……1.56U／ml溶液

；另3枚小鋼管內(nèi)均滴滿(mǎn)標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度Co即1U/ml溶液。如圖4－6經(jīng)培養(yǎng)16～18h后，逐一測(cè)量每一個(gè)抑菌圈直徑。分別求得每組3個(gè)雙碟中心濃度Co所致的抑菌圈直徑平均值Yo及C1～C8所致抑菌圈直徑的平均值，即k(Ck=1-8)。令fk=k－o，分別計(jì)算Fk值，8組雙碟可得出的F1-8的8個(gè)反響參數(shù)以fk值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的抗生素濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，在方紙上標(biāo)點(diǎn)：或以fk值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)抗生素劑量Ck為縱坐標(biāo)，在雙周半對(duì)數(shù)圖紙上標(biāo)點(diǎn)，將各點(diǎn)聯(lián)結(jié)即成標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4－7?；蚪?jīng)計(jì)算，得出回歸直線方程式。3.供試品效價(jià)測(cè)定：

取標(biāo)準(zhǔn)品制備中心濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，并取供試品，預(yù)估效價(jià)后用緩沖液稀釋到與標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度相同的供試液。取備妥的放置6枚小鋼管的雙碟，一般不少于3個(gè)，在每一雙碟中，間隔的3枚小鋼管中分別滴滿(mǎn)中心點(diǎn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，另3枚小鋼管中滴滿(mǎn)供試液。在規(guī)定條件培養(yǎng)后測(cè)量各抑菌圈的直徑。分別求得標(biāo)準(zhǔn)液抑菌圈直徑平均值0和供試液抑菌圈直徑的平均值yk，算出yk-y0的差數(shù)(fk)。據(jù)此在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取供試液的濃度，即可轉(zhuǎn)換成供試品所含效價(jià)U/ml，亦可以代入直線回歸方程式，算出供試品的效價(jià)。三、統(tǒng)計(jì)處理公式1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸在用一劑量法效價(jià)測(cè)定中，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從理論上是要使劑量(lgM)和反響(f)所構(gòu)成的點(diǎn)在一條直線上，但實(shí)際上由于生物差異等因素的存在，各點(diǎn)終歸有些偏離于這條直線，直線回歸就是求出最適合于這些點(diǎn)的直線的方法。直線回歸方程式：y^＝y(tǒng)＋b〔x-x〕(4-17)式中b為回歸系數(shù),即回歸直線的斜率。當(dāng)x增減1個(gè)單位時(shí),y平均增減b個(gè)單位；由于這個(gè)斜率是由各點(diǎn)與(x、y^)構(gòu)成斜率的平均的斜率，在以這平均斜率〔即回歸系數(shù)b〕來(lái)計(jì)算供試品的效價(jià)，這就克服了人為繪制直線存在的缺點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)正確可靠。求b公式如下：b=〔∑xy-x∑y〕/〔∑x2-x∑x〕(4－18)2.β的可信限有些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即使不是直線關(guān)系，也可能按直線回歸的方法求出一條直線來(lái)。此時(shí)回歸系數(shù)已無(wú)法說(shuō)明這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否真正的呈直線關(guān)系。為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)各點(diǎn)符合一條直線的密切程度如何，可應(yīng)用直線性測(cè)驗(yàn)方法，即根據(jù)實(shí)驗(yàn)求得b值，估計(jì)總體β的可信限來(lái)考核，以便對(duì)實(shí)驗(yàn)有個(gè)客觀的分析。y^＝y(tǒng)＋b〔x-x〕(4－19)Sy.x=∑(y-y^)/(n-2)(4－20)Sb=Sy?x/∑(x-x〕2(x-x)(4－21)β=b+t0.05?Sb(4－22)式中y^:由回歸方程式求出的y值，被稱(chēng)為估計(jì)y值，其符號(hào)y^用表示。Sy.x:誤差項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)差Sb:回歸系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤β:總體回歸系數(shù)t0.05的自由度應(yīng)為n-2，因y^值受y及b兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量限制量的限制3.一劑量法的效價(jià)計(jì)算

可用下式:lgR=(yＴ-y8)/b(4－23)PT=R．AT

(4－24)

圖4－8：一劑量法測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖美國(guó)藥典一劑量法YJF-Excel統(tǒng)計(jì)軟件的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

難題解答1.在配制標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液時(shí)如何進(jìn)行樣品稱(chēng)量的計(jì)算?答:方法一按稱(chēng)樣量的計(jì)算公式：W=V·C／P進(jìn)行計(jì)算。公式中W為：需稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量〔mg〕；V為：溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積量〔ml〕；C為：標(biāo)準(zhǔn)品或供試品濃溶液的濃度〔U/ml或μg/ml〕；P為：標(biāo)準(zhǔn)品的純度〔單位數(shù)〕或供試品的估計(jì)效價(jià)(U/ml或μg/mg)。如課本例題：W=50×1000／683＝73．206mg方法二工廠多采用該法稱(chēng)取的樣量mg數(shù)×標(biāo)示的單位數(shù)÷1000＝加溶液的ml數(shù)＝1000u／ml如標(biāo)示單位為628u／mg的抗生素，如稱(chēng)取50mg，那么50×628÷1000＝31．4ml＝1000u／ml的母液。計(jì)算練習(xí)題1．配制含新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1000U/ml的母液50ml，應(yīng)稱(chēng)取多少mg標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品單位為683U/mg)？又如何配制成高劑量(20U/ml)、低劑量(10U/ml)兩種濃度的效價(jià)測(cè)定液？配制時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？2．某批新霉素原料的估計(jì)單位為600U/mg，按藥典要求配制成高劑量(20U/ml)、低劑量(10U/ml)兩種濃度的效價(jià)測(cè)定液，該如何配制？測(cè)定

方法

?中國(guó)藥典?規(guī)定：供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。本節(jié)將詳細(xì)介紹這兩種方法的操作與有關(guān)原理。凝膠法

光度測(cè)定法

濁度法

顯色基質(zhì)法

一、內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系二、開(kāi)展簡(jiǎn)況1991年USP22版第5增補(bǔ)版公布了185種藥品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。第23版那么達(dá)471多種,到1999年24版高達(dá)670余種,而用家兔熱原檢查僅有20多種。2000年國(guó)際調(diào)和委員會(huì)使美國(guó)藥典〔USP〕、歐洲藥典〔EP〕和日本藥局方〔JP〕達(dá)成?BET的國(guó)際調(diào)和案?，統(tǒng)一的BET已收栽于USPXXⅣ版NF19的第二增補(bǔ)本中，并于2001年1月1日生效。隨后USPXXⅤ、USPXXⅥ、USPXXⅤⅡ均正式收栽。1987年歐洲藥典收載了?細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法?，1998年收載品種已達(dá)100多種。1989年英國(guó)藥典〔JP〕收載了該法，到1997年有40余種用該法檢查，2000版收載了147種。1991年日本藥局方也收載了該法，14藥局方也超過(guò)200多種。2.我國(guó)的研究應(yīng)用概況：1978年我國(guó)藥檢系統(tǒng)開(kāi)始研究鱟試驗(yàn)法。1983年，開(kāi)始組織了鱟試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的研究，確立了生物活性效價(jià)單位(內(nèi)毒素單位EU)表示的我國(guó)內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品；確定了以此標(biāo)準(zhǔn)品10EU/Kg為靜脈注射藥品的致熱閾值(K)。1988年藥典委員會(huì)指導(dǎo)制定了?細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法?和鱟試劑標(biāo)準(zhǔn)，作為4種劑型注射液熱原檢查初試方法，10月在全國(guó)試行。1991年9月轉(zhuǎn)為正式部標(biāo)準(zhǔn)。1995年版中國(guó)藥典收載，規(guī)定細(xì)菌內(nèi)素檢查品種13個(gè)。2000年版?中國(guó)藥典?〔二部〕做了修訂，收載了?細(xì)菌內(nèi)素檢查法應(yīng)用原那么?，檢查品種69種。?中國(guó)藥典?(2005年版)再次做了重大修訂,〔一部〕〔二部〕〔三部〕均收載了?細(xì)菌內(nèi)素檢查法?，增修訂檢查品種達(dá)112種，其中〔二部〕就收載檢查品種186種；〔三部〕收載檢查品種19種。三、開(kāi)展趨勢(shì)與特點(diǎn)1．國(guó)家藥典收載成為開(kāi)展的必然趨勢(shì)2．內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查成為必然的方法

3．走向統(tǒng)一的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法USP、EP和JP自2001年實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)一。4.應(yīng)用的方法越來(lái)越多

(1)方法多樣化〔2〕方法自動(dòng)化〔3〕方法微量化5．應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣四、根本概念和反響原理概念:本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。凝膠法光度測(cè)定法濁度法和顯色基質(zhì)法供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位〔EU〕表示。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法2.內(nèi)毒素和鱟試劑的反響機(jī)理:以簡(jiǎn)式表示如下：內(nèi)毒素↓C因子─→活化因子旁路↓ＬＡＬ-ＲＭ或Ｂ因子─→活化因子β-Ｄ-葡聚糖↓↓凝固酶原─→凝固酶活化Ｇ因子←←Ｇ因子〔激活〕│∕↓↙凝固蛋白原───→凝固蛋白〔酶解〕│交聯(lián)酶│(聚合)凝膠凝膠如下圖該反響出現(xiàn)凝膠為陽(yáng)性；假設(shè)無(wú)出現(xiàn)或凝膠脫落那么為陰性3.細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(RSE)系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)的效價(jià)和標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其重量的相當(dāng)效價(jià)。每1ng工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)應(yīng)不小于2EU，不大于50EU。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用于鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。4.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET)是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專(zhuān)用水〔本節(jié)所指的水均是該專(zhuān)用水〕。凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。光度法測(cè)定用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。5.

鱟試劑與鱟試劑靈敏度鱟試劑的種類(lèi)鱟試劑〔LAL〕中國(guó)鱟試劑〔TAL〕園尾鱟試劑〔CAL〕美國(guó)生產(chǎn)中國(guó)與日本生產(chǎn)檢查方法凝膠法鱟試劑定量法鱟試劑反響程度普通鱟試劑特殊性鱟試劑〔3〕鱟試劑規(guī)格是多少，就用多少細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶試劑使用，如規(guī)格是0．5ml的試劑，就用0．5ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶。〔4〕鱟試劑靈敏度是指在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的條件下(規(guī)定條件下)能檢測(cè)出內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液或供品溶液中的最低內(nèi)毒素濃度。(即能與鱟試劑發(fā)生陽(yáng)性反響的最低濃度)。以EU/ml表示。如λ=0.5EU/ml；0.25EU/ml等。6.細(xì)菌內(nèi)毒素限值(Ｌ):指哺乳動(dòng)物(或人)對(duì)藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素所能耐受的不致于引起熱原反響的某定量限值的量單位稱(chēng)之。為保證用藥平安。給每一種藥物規(guī)定了相應(yīng)的限值,用L表示。只要低于該限值,按規(guī)定給藥途徑用藥就是平安的。在進(jìn)行檢查時(shí),首先要知道該品種的L值。確定藥品品種L值的方法:１.在藥典正文中查出:各國(guó)藥典規(guī)定作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種，都可在藥典正文中查到相應(yīng)的L值。如?中國(guó)藥典?〔2005年版〕〔二部〕規(guī)定了186種注射劑的L值,〔三部〕規(guī)定了19種注射劑的L值;USPXXIV版規(guī)定了670種注射劑的L值。如：18-AAL值確實(shí)定:每小時(shí)人的公斤體重最大注射劑量是10ml(大輸液一般是10ml),L=5ＥＵ/ml／10ml=０.５EU/ml

２.根據(jù)人的最大用藥劑量計(jì)算而得:按公式L=K/M確定。式中L：供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU／ml,EU／mg或EU／u表示；K：按規(guī)定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時(shí)接受額定最大內(nèi)毒素劑量，以Eu〔kg．h〕。一般注射劑：K=5EU/〔kg·h〕；放射性藥品注射：K=2.5EU/〔kg.h〕；鞘內(nèi)用注射劑：K=0.2Eu/〔kg.h〕。M：為人體每公斤體重每小時(shí)最大用藥劑量，以ml〔kg.h〕,mg/(kg.h)或u〔kg.h〕表示，中國(guó)人均體重按60kg計(jì)算。按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需要說(shuō)明理由。7.MVD〔最大有效稀釋倍數(shù)〕(MVD)按下式計(jì)算：MVD＝CL／λ式中L為細(xì)菌內(nèi)毒素的限值。C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，那么C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，C的單位需為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，那么MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度〔EU/ml〕，或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。8．供試品溶液的制備

某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液〔或其稀釋液〕的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。(一)檢查程序：

實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及用具等的準(zhǔn)備

確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L

選擇鱟試劑的靈敏度λ

計(jì)算供試品的最大有效稀釋MVD或最低有效濃度MVC

鱟試劑的靈敏度復(fù)核

藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)〔無(wú)干擾濃度初篩〕供試品的干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證〔正式干擾試驗(yàn)〕供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查(二)試驗(yàn)的準(zhǔn)備工作與材料鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素旋渦混合器與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查儀(凝膠法〕

旋渦混合器TAL－40型試管恒溫儀

〔三〕確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值〔L值〕見(jiàn)前述。

〔四〕選擇鱟試劑的靈敏度λ

〔五〕計(jì)算供試品的最大有效稀釋MVD或最低有效濃度MVC具體步驟

1.稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素

2.靈敏度復(fù)核的操作步驟

3.靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

〔六〕鱟試劑靈敏度復(fù)核?中國(guó)藥典?規(guī)定當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。由此可見(jiàn)，進(jìn)行復(fù)核的目的更重要的是對(duì)試劑、檢測(cè)者的操作、環(huán)境條件、水平條件進(jìn)行驗(yàn)證。以證實(shí)操作正常無(wú)誤，準(zhǔn)確可靠和結(jié)果可信。1.稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素

加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶

封口膜封閉安瓶口

用水稀釋成2λ、1λ、l／2λ、1/4λ濃度的系列溶液，即0．12、0.06、0.03、0.015EU／ml濃度的系列溶液。靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的具體步驟

稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素步驟如下:〔符號(hào)E20表示濃度為20EU/ml的內(nèi)毒素溶液，其余類(lèi)推〕：Ｅ２0

0.4mlE20混合30秒1.6ml水

0.9mlE2.0E2.0混合30秒0.9ml0.9mlE1.0混合30秒0.9ml1.8mlE0.25混合30秒1.8mlE0.125【本卷須知】稀釋過(guò)程每一步驟所用的移液器具不能交叉混用！1.8mlE0.5混合30秒1.8ml2．靈敏度復(fù)核操作

使用λ=0.5EU/ml的鱟試劑進(jìn)行復(fù)核。取鱟試劑先消毒處理、斷開(kāi)瓶頸部后、放入反響板孔中如以下圖排列：〔NC表示陰性對(duì)照〕—————————————————————Ｅ2λＥ1.0λE0.5λE0.25λ〔EU/ｍl〕1.00.50.250.125NC—————————————————————1＊●●●●●鱟2＊●●●●●試3＊●●●●劑4＊●●●●先加：然后再加：0.1ml0.1ml

0.1ml

0.1ml

相應(yīng)λ的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素Ｅ２λＥλE0。5λE0。25λ保溫37℃1h，然后觀察結(jié)果0.１ml0.1ml0.1ml0.1ml0.2ml水復(fù)溶鱟試劑水+水+水+水+水實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：將試管緩慢翻轉(zhuǎn)“180０〞，假設(shè)管內(nèi)凝膠顯示堅(jiān)實(shí)不變形為陽(yáng)性，記錄為“＋〞〔陽(yáng)性〕；假設(shè)無(wú)凝膠出現(xiàn)，或雖有凝膠但不能保持完整，從管壁滑脫，均判為陰性，記錄為“－〞〔陰性〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷返回結(jié)果判斷:

如標(biāo)準(zhǔn)溶液最大濃度2.0λ的4管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ的4管均為陰性，陰性對(duì)照(NC)均為陰性，可按下式計(jì)算鱟試劑靈敏度測(cè)定值(λc)。ΣXλc＝lg-1[───]4式中X為反響終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值〔lg〕。反響終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以λ為該批鱟試劑的靈敏度。3．靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

按下式計(jì)算鱟試劑靈敏度復(fù)核值〔λc〕：ΣXλc＝Lg－１[——]４式中X為反響終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值?！居?jì)算舉例】反響結(jié)果如下表：———————————————————————————————————(EU/ml)1.00.50.250.125NC反響終點(diǎn)Ｘ———————————————————————————————————l＃十十十一一2＃十十一一一3＃十十一一一4＃十十一一一————————————————————————————————————0.250.50.50.5-0.602-0.301-0.301-0.301注：凡只要各λ中的任何一管出現(xiàn)了+，該反響值對(duì)應(yīng)的λ值即為該反響濃度的反響終點(diǎn)值。根據(jù)以下方式計(jì)算λc：

ΣXλc＝Ｌg－１————４(-0.602)+(-0.301)+(-0.301)+(-0.301)＝Ｌg－１———————————————————————————————４＝Lg?1(-0.376)＝0．42Eu／ｍl即靈敏度復(fù)核值λｃ＝0.42EU／ml。由于0.5λ＜λｃ＜2λ，本批鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值正確，應(yīng)按標(biāo)示值λ=0.5EU／ml使用。假設(shè)復(fù)核的結(jié)果不是內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液最大濃度〔2.0λ〕的4管全陽(yáng)性，最小濃度(0.25λ)4管全陰性，本批鱟試劑不能使用，須查找原因?？赡苁庆`敏度標(biāo)示不準(zhǔn)確，或是內(nèi)毒素效價(jià)標(biāo)本不準(zhǔn)確，或是操作不當(dāng)?shù)脑驅(qū)е?應(yīng)重試。假設(shè)復(fù)核時(shí)陰性對(duì)照(ＮＣ)均為陽(yáng)性,試驗(yàn)無(wú)效,應(yīng)重試。返回判斷鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)錄像播放鱟返回我國(guó)藥檢系統(tǒng)研究鱟試驗(yàn)法返回1995年版中國(guó)藥返回2000年版?中國(guó)藥典?將試管緩慢翻轉(zhuǎn)180０返回(七)供試品干擾試驗(yàn)1.干擾試驗(yàn)的目的是判斷檢品在某種濃度狀態(tài)下是否適合做細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,這樣的判斷還包括以下條件的改變是否對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有影響：〔l〕鱟試劑來(lái)源的改變；〔2〕鱟試劑制備工藝的改變；〔3〕檢品生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變；〔4〕檢品關(guān)鍵成分來(lái)源的改變；〔5〕鱟試劑批號(hào)的改變。因某些藥品對(duì)鱟試劑的凝集反響可能有抑制或增強(qiáng)作用,分別使試驗(yàn)得出假陰性或陽(yáng)性的結(jié)果，因此在檢查前首先驗(yàn)證樣品是否對(duì)試驗(yàn)有干擾作用。故又稱(chēng)為抑制或增強(qiáng)試驗(yàn)。往往在正式進(jìn)行干擾試驗(yàn)檢查前先進(jìn)行無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)。2.無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)方法在正式進(jìn)行干擾試驗(yàn)前可先做一次無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn),用以確定無(wú)干擾濃度。下面以清開(kāi)靈檢品所示表達(dá)無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)方法。(1)樣品的等倍稀釋設(shè)清開(kāi)靈檢品為S，其內(nèi)毒素限值L＝1EU／ml，〔根據(jù)某廠內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)而訂，假設(shè)根據(jù)人用最大劑量劑量計(jì)算應(yīng)為K／M＝5．0EU／ml／［40ml／60kg］＝7．5EU／ml〕。使用鱟試劑的靈敏度為λ=0．06EU／ml，由此得到最大有效稀釋MVD＝Ｌ/λ＝1／0．06＝16(倍)。以16倍為基準(zhǔn)作一系列不同倍數(shù)的稀釋?zhuān)M(jìn)行無(wú)干擾濃度檢查試驗(yàn)0.2ml原液0.9ml—————→混合30秒(16倍)——→混合30秒(32倍)3.0ml水0.9ml水0.9ml0.9ml———→混合30秒(64倍)———→混合30秒(128倍)0.9ml0.9ml0.9ml———→混合30秒(256)0.9ml(2)制備Es〔標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素〕系列用BET水稀釋內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，方法與鱟試劑靈敏度復(fù)核相同，得到一個(gè)系列的2λ、0．5λ、0．25λ、0．125λ內(nèi)毒素水溶液〔E０.１２，E０.０６，E０.０３，E０.０１5，〕這個(gè)系列我們稱(chēng)為Es系列。(3)按表5－5所示加樣操作：

表5－5：無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)加樣圖

163264128PCNCNPC管ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯ0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1ml水0．2ml水

＋＋＋＋＋

0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlE２λPPC管ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯ0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1ml水0．2ml水

＋＋＋＋＋

0.1mlE２λ0.1mlE２λ0.1mlE２λ0.1mlE2λ0.1mlE２λ

NPC管為〔-〕，PC管為〔＋〕，NC管為〔－〕的情況下,假設(shè)PPC低稀釋倍數(shù)管為〔-〕,高稀釋倍數(shù)管均為〔＋〕時(shí),說(shuō)明出現(xiàn)陽(yáng)性的該濃度檢品無(wú)干擾,試驗(yàn)結(jié)果成立,可正式以該濃度進(jìn)行干擾試驗(yàn)加以確證，如表5－6所示。表5-6：清開(kāi)靈檢品無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果λ=0.5EU/ml163264128PCNCNPC●●●●●●●●●●●●一一一一一一一一＋＋一一PPC●●●●●●●●●●一一＋＋＋＋＋＋＋＋圖5－6顯示：清開(kāi)靈檢品在16倍時(shí)有干擾〔PPC陰性〕，而在32倍時(shí)無(wú)干擾〔PPC開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性〕。假設(shè)PC管為〔－〕,或NC管為〔＋〕任一現(xiàn)象時(shí)，試驗(yàn)無(wú)效，須分析原因?；騊PC管全為〔-〕或全〔＋〕現(xiàn)象時(shí)，須分析原因。3．干擾試驗(yàn)確證取檢品SＭＶＤ來(lái)〔SＭＶＤ32經(jīng)無(wú)干擾濃度篩選試驗(yàn)證實(shí)的濃度〕進(jìn)行確證。(1)將檢品稀釋成SＭＶＤ32,然后代替鱟試劑復(fù)溶液來(lái)溶解鱟試劑(2)制備E系列〔標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素〕：(3)取鱟試劑分別用檢品SＭＶＤ復(fù)溶后與上述內(nèi)毒素系列(Ｅ系列)反響，方法與靈敏度復(fù)核相同。而陰性對(duì)照(NC)是每管加0．2ml的復(fù)溶液。如表5-7所示。表5-7：干擾試驗(yàn)確證圖

管2λλ0.5λ0.25λPCNC1＊

●●●●●●2＊

●●●●●●3＊●●●●4＊

●●●●

0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1ml水0.2ml水

+++++0.1mlE２λ0.1mlEλλλ0.1mlSMVD假設(shè)干擾試驗(yàn)結(jié)果PC全陽(yáng)性和ＮＣ全陰性，同時(shí)內(nèi)毒素最大濃度〔2λ〕4管全陽(yáng)性，最小濃度(0．25λ)4管全陰性，本次試驗(yàn)該樣品SＭＶＤ為無(wú)干擾作用；假設(shè)內(nèi)毒素最大濃度〔2λ〕4管和最小濃度0．25(λ)4管全陰性，本次試驗(yàn)為有干擾。假設(shè)PC全陰性和ＮＣ全陽(yáng)性，試驗(yàn)無(wú)效,須查找原因?？赡苁遣僮鞑划?dāng)?shù)鹊脑驅(qū)е?應(yīng)重試。試驗(yàn)的結(jié)果將得到兩個(gè)靈敏度值。由于E系列的試驗(yàn)與鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)完全相同，因此用同一符號(hào)λc表示靈敏度值；用λs表示E／S系列試驗(yàn)的靈敏度值。4．試驗(yàn)中各種對(duì)照的作用與意義〔1〕PC(陽(yáng)性對(duì)照)的作用在于確證檢查時(shí)所用的鱟試劑對(duì)內(nèi)毒素具有必需的最低限度的生物活性。〔2〕NC(陰性對(duì)照)的作用在于防止試劑或器具自身的污染影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性?！?〕NPC(陰性產(chǎn)品對(duì)照〕的作用是防止檢查出現(xiàn)假陽(yáng)性,假設(shè)出現(xiàn)陰性對(duì)照管陰性，說(shuō)明供試品在MVD濃度狀態(tài)下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾〔抑制作用〕,試驗(yàn)正確?！?〕PPC(陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照)的作用是防止檢查出現(xiàn)假陰性的一個(gè)簡(jiǎn)單而十分有效的方法。它實(shí)際上是做了干擾試驗(yàn)的抑制局部，相當(dāng)于半個(gè)干擾試驗(yàn)。PPC結(jié)果應(yīng)陽(yáng)性,假設(shè)出現(xiàn)PC管陽(yáng)性，但PPC管陰性的結(jié)果，說(shuō)明供試品在MVD濃度狀態(tài)下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾〔抑制作用〕，雖然S1及S2管陰性，并不能完全證實(shí)供試品是合格產(chǎn)品，此種陰性結(jié)果可能是假陰性。出現(xiàn)這情況，需要對(duì)供試品作消除干擾的處理。通常消除于擾最簡(jiǎn)單有效的方法是改用更高靈敏度〔即λ值更小〕的鱟試劑，對(duì)供試品作更大倍數(shù)的稀釋后再作檢查。5．PC或NC結(jié)果異常的原因分析〔1〕PC結(jié)果出現(xiàn)〔-〕可能是由下述原因造成：內(nèi)毒素工作品效價(jià)標(biāo)示不準(zhǔn)確或效價(jià)衰退或失效；稀釋內(nèi)毒素沒(méi)有使用旋渦混合器或稀釋操作不當(dāng)；鱟試劑效價(jià)標(biāo)示不準(zhǔn)確或效價(jià)衰退或失效；反響試管放入水浴保溫前試管中內(nèi)容物沒(méi)有搖勻?！?〕NC結(jié)果出現(xiàn)〔＋〕可能是由下述原因造成：鱟試劑或水污染；實(shí)驗(yàn)器具污染；實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作不當(dāng)污染。(八〕檢品日常的內(nèi)毒素限量檢查面仍以清開(kāi)靈為例說(shuō)明日常內(nèi)毒素檢查的方法及操作步驟：設(shè)：檢品為S，L＝1.0EU／ml，選用規(guī)格為0.06EU／支，λ=0.06EU／ml的鱟試劑，MVD＝16〔倍〕，使用的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為10EU／支。參數(shù)λ及MVD已經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證。(1)取內(nèi)毒素工作品1支，用水把它稀釋成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液，即E０.１２。其操作參照前述靈敏度的復(fù)驗(yàn)。(2)取檢品S，把它稀釋成SMVD0.9ml0．2mlS＋3．0ml水—→SMVD16——→SMVD320.9ml(3)取鱟試劑(0.1ml/支)10支，其中4支分別標(biāo)記S1,S2〔樣品檢查管〕，2支標(biāo)記PC管,2支標(biāo)記PPC管〕,2支標(biāo)記NC管，然后插入試管架中，如表5－8所示，并按表5－8所示加樣液。表5-8:檢品日常的內(nèi)毒素限量檢查加樣液示意圖S1S2PCPPCNC●●●●●●●●●●0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1mlSMVD0.2ml水++++0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlE２λ0.1mlE２λ(4)封閉管口，搖勻，放入37±1℃恒溫水浴保溫60±2分鐘，取出觀察結(jié)果，記錄結(jié)果。觀察結(jié)果的方法如前述靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。(5)檢查結(jié)果的判斷及處理在PC管為〔＋〕，PPC管為〔＋〕，NC管為〔－〕的情況下，假設(shè)2支S管均為〔＋〕，說(shuō)明檢品中的內(nèi)毒素含量等于或大于規(guī)定限值，不合格；假設(shè)2支S管均〔－〕，說(shuō)明檢品中的內(nèi)毒素含量小于規(guī)定限值，合格；假設(shè)2支S管中1管為〔＋〕，應(yīng)按上述方法進(jìn)行復(fù)試，取4支S管復(fù)試，假設(shè)所有4支平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否那么判供試品不符合規(guī)定。假設(shè)PC管為〔－〕,或PPC管為〔-〕，或NC管為〔＋〕任一現(xiàn)象時(shí)，試驗(yàn)無(wú)效，須分析原因。假設(shè)出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照管〔PC〕陽(yáng)性，但陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照管〔PPC〕陰性的結(jié)果，說(shuō)明供試品在MVD濃度狀態(tài)下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾〔抑制作用〕，雖然S1及S2管陰性，并不能完全證實(shí)供試品是合格產(chǎn)品，此種陰性結(jié)果可能是假陰性。出現(xiàn)這情況，需要對(duì)供試品作消除干擾的處理。通常消除干擾最簡(jiǎn)單有效的方法是改用更高靈敏度〔即λ值更小〕的鱟試劑，對(duì)供試品作更大倍數(shù)的稀釋后再作檢查。第十三章生物活性檢定一、生物測(cè)定的特點(diǎn)：

1.生物差異性大

2.實(shí)驗(yàn)誤差大實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般不及理化檢驗(yàn)準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)誤差通常在10～20％之間。甚至更大。

3.實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，人力、物力消耗大，計(jì)算較繁

二、減少生物差異性的方法與措施

1.從實(shí)踐和理論上了解各被試物對(duì)所用動(dòng)物的生物反響差異性的規(guī)律2.調(diào)整樣本的大小

3.對(duì)供試用動(dòng)物進(jìn)行條件因素的限制

4.研究各種實(shí)驗(yàn)方法的反響類(lèi)型5.用生物統(tǒng)計(jì)方法提高實(shí)驗(yàn)的可靠性

三、生物反響類(lèi)型(一)量反響當(dāng)一定劑量的藥物作用于生物體時(shí)，所引起的反響是可以計(jì)量大小的(觀察藥物反響的程度，可以用數(shù)字來(lái)表示其大小)。如器官長(zhǎng)度的伸縮、血壓的上下、器官重量的增減，抑菌圈直徑的大小、凝血時(shí)間的長(zhǎng)短等。(二)質(zhì)反響當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反響或反響的某一程度出現(xiàn)與否(只出現(xiàn)正負(fù)反響兩種情況，而無(wú)程度之別，如死或不死、驚厥或不驚厥)，所引起的反響只有質(zhì)的變化，即此類(lèi)反響只可計(jì)數(shù)而不能用定量的方法表示個(gè)體反響程度。不少藥物可選用不同類(lèi)型的反響指標(biāo)來(lái)進(jìn)行生物測(cè)定。如胰島素效價(jià)測(cè)定可以選用小鼠驚厥法，又可選用血糖降低法等；在選用反響指標(biāo)時(shí)，應(yīng)考慮反響的專(zhuān)屬性及檢定結(jié)果的精密度，一般要注意以下幾點(diǎn)：(1)同質(zhì)反響的劑量范圍要寬生物測(cè)定必須在同質(zhì)反響根底上進(jìn)行，而藥物同質(zhì)反響一般都有一定的劑量范圍，超出了一定的劑量范圍，反響性質(zhì)可能發(fā)生變化。(2)同劑量各次反響的差異要小即指標(biāo)的重現(xiàn)性要好，此時(shí)檢定結(jié)果才比較可靠。(3)反響程度隨劑量的變化要有顯著改變。(4)劑量與反響的關(guān)系可用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)式表示。四、劑量和反響的關(guān)系生物測(cè)定是利用藥物不同劑量引起生物體反響程度的變化以進(jìn)行藥物效價(jià)測(cè)定的，要計(jì)算效價(jià)，首先要研究劑量和反響之間的關(guān)系。許多藥物在相當(dāng)寬的劑量范圍里，劑量和反響之間存在著一定的規(guī)律性，并可用一定的數(shù)學(xué)公式表示，研究劑量和反響關(guān)系，根本內(nèi)容就是找出這個(gè)規(guī)律，并采用坐標(biāo)轉(zhuǎn)換的方法解決曲線轉(zhuǎn)換為直線的問(wèn)題，以便用最簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。通常以劑量作橫坐標(biāo)，反響為縱坐標(biāo)，在方格紙上劃點(diǎn)連線，由所成的劑量－反響曲線形狀推斷劑量或反響應(yīng)作何種函數(shù)轉(zhuǎn)換,直至劑量－反響線在一定范圍內(nèi)成直線。劑量－反響線的斜率對(duì)檢定結(jié)果有重要意義，斜率越大，說(shuō)明反響對(duì)劑量變化越敏感，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就越精密可靠。