分子克隆技術(shù)實驗指導(dǎo)

分子克隆技術(shù)DNA（MolecularCloning分子克隆技術(shù)DNA（MolecularCloning）DNA分子按照既定的目的進(jìn)行實驗前準(zhǔn)備PCR擴增及酶切，連接所需酶類試心（小于4000rpm）放置冰浴中備用。本次實驗所涉及的常規(guī)儀器及耗材有：ThermoScientificArktikPCR儀，水F1，F(xiàn)2F3一系列量程的單道移液器等儀器，1.5ml離心管，玻璃試管，賽默飛公司提供的QSP盒裝吸頭及15ml離心管等。GenBank查詢目的基因序列GenBank查詢目的基因序列找到編碼區(qū)所在位置，β-ActinCDS80-1207，點擊復(fù)制編碼序列，并保存為.seq格式。根據(jù)CDS序列設(shè)計引物DNAstarMapDrawFileCDS.seq，點okCDSMapAbsentSites，可見游引物的酶切位點為BamHⅠ，下游引物的酶切位點為HindⅢ。PrimerPremier5軟件，點擊FileNew，DNASequence。在彈出GeneTank窗口中，粘貼入β-Actin的基因全長序列，選擇Asis，ok確定.Primer進(jìn)入PrimerPremier窗口，點擊SearchSearchCriteria窗口PCRPrimer，searchtypePairs。還可以設(shè)定搜索區(qū)域及產(chǎn)物長度。由于CDS的位置是80-1027，上游引物搜素區(qū)域為1-80bp；下游則為1027-1885bp；產(chǎn)物長度為900-1300bp；引物長度一般為18-30bp，無需修改。在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，設(shè)置完畢后，點擊ok開始搜索引物。SearchProgressokSearchResult窗口，搜選擇評分最高的引物，簡單查看一下引物情況，避免出現(xiàn)一下情況：33GGG應(yīng)該在55～70度之間，上游引物和下游引物 值最好不要相差太多，大概在％應(yīng)該在選中上游引物，點擊 Primer。在引物編輯窗口的編輯欄中，5’端添加BamHⅠ的序列（GGATCC）BamHⅠ的序列（GGATCC）,點擊Analysis.根據(jù)結(jié)果添加合適的保護(hù)堿基再次分析后，點擊Primer。如符合條件，點OK，將編輯好的引物輸送到同樣的方法設(shè)置下游引物，在編輯欄中5’端添加入HindⅢ的序列OK，接受引物。RT-PCR獲取目的基因0.2μl10mMdNTP、上下游引物各0.3μl、0.3μlTaq酶，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA模板2μl，最后加RNA酶純水調(diào)整至20μl。72°C2min,2812°C保溫。PCRrun按鈕，選擇設(shè)定好的程序，按START開始運行。瓊脂糖凝膠電制備1%瓊脂糖凝形瓶中加入0.3g的瓊脂糖和30ml的TAE緩沖液TAE緩TAE緩沖液。假如適量的6LoadingBuffer，混勻后即可上樣。膠回收及DNA的純化水浴中溫浴，每2-3min搖動混合物至凝膠完全融化，1min，12000rpm2min，棄收集管中的濾液，將離心柱套回收集管內(nèi)。WB至離心柱中。12000rpm2minBufferWB在使用之前必須1.5ml30μlElutionBuffer到柱基質(zhì)上，室溫放置1min12000rpm1minDNA。酶切目的基因和載體,在擴增產(chǎn)物組標(biāo)記T，載體在擴增產(chǎn)物組標(biāo)記T，載體組CPCR管中加入如下成分：2μl10x酶切緩沖液，6μl的蒸餾水，BamHHind1μl。TPCR擴增產(chǎn)物10μl，C組加入10μlpET-28α載體10μl?；靹蚝?，用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底，37°C酶切3-4h，酶切結(jié)束后，65°C保溫5-10min以終止酶切及防止DNA末端退火，取出后置冰浴驟冷，酶切產(chǎn)物可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。目的基因和載體連接反應(yīng)TPR4μlA15μlET28a載體，1μl10xT4bufr，0.μlT4A10μl。在陰性對照組CPR.μlpT28α1l0xT4fr.μlT4A10μl。對于有效的連接體系來說合適的載體和目的基因分子數(shù)比值控制在一定范圍內(nèi)是有必要的，這個比值為1：31：10，較大的片段可適當(dāng)提高比值。連接時，PR產(chǎn)物濃度可以盡可能的大，輕混反應(yīng)物，并在161216h4℃連接過夜。轉(zhuǎn)化及篩選轉(zhuǎn)化前，需進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備10μlDH5α2mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃每分鐘180-200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量將甘油菌種20μl接種到2mlLB培養(yǎng)基中，37OD6000.3～0.43h。在超凈工作臺里用槍頭小心移去上將菌體重新懸浮于400μl預(yù)冷的20min大腸桿菌的轉(zhuǎn)化（熱激法移液器輕輕吸打使連接產(chǎn)物質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞充分混合，冰浴30min90s，將管轉(zhuǎn)移到冰浴中將管放入預(yù)加溫42℃的水浴中1ml無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C1ml無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C0.5-1h；37℃培養(yǎng)，12-16h后可出現(xiàn)菌落。次日，取出平板觀察，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR?？焖勹b定陽性重組子PCR2μl10×PCRBuffer，1μldNTPmix，2μl上游引物，2μl總體系進(jìn)行分裝，只需在體積數(shù)乘上樣品數(shù)加1的總體系。LBEP2-3次，然后將同一槍頭浸入裝有PCRmixture的PCR管中反復(fù)吹打以作擴增培養(yǎng)細(xì)菌用；另取一PCR管，不加轉(zhuǎn)化子模板，作為陰性對照。初步鑒定陽性重組子，一定致，只需調(diào)用相應(yīng)的程序，按Start運行即可。5μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳分析。紫外檢測儀下觀察，陽性重組子能得到相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒提取及鑒將上清移至另一新離心管中，加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，打碎或吸走。12000rpm離心5min，小心用棄去上清，注意不要將沉淀倒走20μlRNaseADNA實驗結(jié)果與分析：PR-PCR1200bp疑問與解答DoctorA，實驗做完了，結(jié)果也比較理想，但是有幾個問題需要請教一下。在PCR擴增過程中，退火時，為什么引物與模板雜交，而模板之間不復(fù)性？MissQ你這個問題問得很好，很多人都不明白這個問題，之所以模板質(zhì)檢DNADNA這是個很常見的問題，很多學(xué)生在做實驗時都會碰到。若PCRPCR這是個很常見的問題，很多學(xué)生在做