第三章生物信息的傳遞（上）RNA的轉(zhuǎn)錄94

第三章生物信息的傳遞〔上〕

RNA的轉(zhuǎn)錄一、RNA的轉(zhuǎn)錄二、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始三、終止與抗終止四、mRNA的特征與比較五、轉(zhuǎn)錄后修飾本章主要內(nèi)容復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：1.都以DNA為模板2.原料為核苷酸3.合成方向均為5′→3′方向4.都需要依賴(lài)DNA的聚合酶5.遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律6.產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈不同點(diǎn)：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均作為模板模板鏈作為模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRN配對(duì)A-T；G-CA-U；T-A；G-C★引物需RNA引物--------★方式(特點(diǎn))半保存復(fù)制不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄引言1、RNA的結(jié)構(gòu)與種類(lèi)結(jié)構(gòu)：ATP－UTPGTP－CTP大分子結(jié)構(gòu)：?jiǎn)捂滊p螺旋區(qū)三葉草結(jié)構(gòu)種類(lèi)：mRNArRNAtRNA轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板合成與DNA鏈序列完全相同〔T－U除外〕的RNA單鏈的過(guò)程。主要步驟：起始、延伸、終止等DNA分子雙鏈的劃分：

編碼鏈：不作復(fù)制模板的DNA單鏈，又稱(chēng)有義鏈模板鏈：作復(fù)制模板的DNA單鏈，又稱(chēng)反義鏈一、RNA的轉(zhuǎn)錄以DNA為模板合成RNA的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄〔transcription〕。轉(zhuǎn)錄是生物界RNA合成的主要方式，是遺傳信息朋DNA向RNA傳遞過(guò)程，也是基因表達(dá)的開(kāi)始〔圖17-1〕。轉(zhuǎn)錄也是一種酶促的核苷酸聚合過(guò)程，所需的酶叫做依賴(lài)DNA的RNA聚合酶〔DDRP〕。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄物為RNA前體〔RNaprecursor〕，它們必須經(jīng)過(guò)加工過(guò)程變?yōu)槌墒斓腞NA，才能表現(xiàn)其生物活性。1、轉(zhuǎn)錄的根本過(guò)程轉(zhuǎn)錄的主要過(guò)程見(jiàn)圖，為研究和表達(dá)方便，可將RNA合成分為模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)和終止四個(gè)階段。模板識(shí)別：RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA作用并與之結(jié)合。在DNA形成轉(zhuǎn)錄泡。通過(guò)啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄起始后直到9個(gè)核苷酸短鏈轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)：RNA聚合酶離開(kāi)啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并產(chǎn)生新RNA鏈伸長(zhǎng)。終止：不再形成磷酸二酯鍵，RNA－DNA別離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)雙鏈。RNA酶促合成的特點(diǎn)：〔1〕合成原料為ATP、GTP、CTP、UTP〔2〕的RNA在NDA模板上以RNA聚合酶酶促合成〔3〕只有一條DNA鏈作為一個(gè)基因的RNA模板，這可用人工分子雜交試驗(yàn)證實(shí)?！?〕RNA鏈按照5‘－3’方向〔DNA鏈的3‘－5’〕定向合成，因此RNA5‘端為三磷酸鍵。2、轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分〔1〕依賴(lài)DNA的RNA聚合酶〔DDRP〕真核和原核細(xì)胞內(nèi)都存在有DDRP，迄今發(fā)現(xiàn)的DDRP的有以下特點(diǎn)：①以DNA為模板；在DNA的兩條多苷酸鏈中只有其中一條鏈作為模板〔模板鏈〕，所以這種轉(zhuǎn)錄方式又叫做不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。③都遵循DNA與RNA之間的堿基配對(duì)原由，A=U，T=A，C=G，合成與模板DNA序列互補(bǔ)的RNA鏈。④RNA鏈的延長(zhǎng)方向是5’→3’的連續(xù)合成。⑤需要Mg2+或Mn2+離子。⑥并不需要引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，所以沒(méi)有校正功能。細(xì)菌染色體上幾個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的方向及所用模板RNA聚合酶催化以下反響：RNA聚合酶的作用：〔1〕RNA聚合酶與DNA分子結(jié)合并識(shí)別DNA分子上的起始信號(hào)〔全酶專(zhuān)一地與DNA啟動(dòng)子序列結(jié)合〕RNA聚合酶的δ因子是識(shí)別啟動(dòng)子序列的主要因子，不同的δ因子使RNA聚合酶識(shí)別不同的啟動(dòng)子序列〔2〕RNA聚合酶使DNA雙鏈由封閉型復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放性復(fù)合體，使DNA局部解螺旋?！?〕催化磷酸二酯鍵形成，使RNA鏈延長(zhǎng)〔4〕識(shí)別DNA上的終止子序列，使RNA合成終止。大腸桿菌RNA聚合酶的研究得比較透徹的，這是一個(gè)分子量達(dá)50多萬(wàn)，全酶由五個(gè)亞基組成，去掉δ亞基的局部稱(chēng)為核心酶，核心酶本身就能催化苷酸間磷酸二酸鍵形成。利福平和利福霉素能結(jié)合在β亞基上而對(duì)此酶發(fā)生強(qiáng)烈的抑制作用。β亞基似乎是酶和核苷酸底物結(jié)合的部位。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是在DNA特定的起始點(diǎn)上開(kāi)始的，δ亞基的功能是識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的。β’亞基是酶與DNA模板結(jié)合的主要成分。α亞基可能與轉(zhuǎn)錄基因的類(lèi)型和種類(lèi)有關(guān)。大腸桿菌RNA聚合酶亞單位分子量亞單位數(shù)組分功能α365122核心酶決定哪種基因被轉(zhuǎn)錄核心酶組裝β1506181核心酶與轉(zhuǎn)錄全過(guò)程有關(guān)形成活性中心β1556131核心酶結(jié)合DNA模板δ702631δ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子真核生物中已發(fā)現(xiàn)有四種RNA聚合酶，分別稱(chēng)為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和線粒體RNA聚合酶，分子量大致都在50萬(wàn)道爾頓左右，它們專(zhuān)一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，因此由它們催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也各不相同。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最顯著，它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因。而細(xì)胞內(nèi)絕大局部RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ，位于核質(zhì)中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前體。RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。真核生物轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需另一此叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程真核生物的RNA聚合酶種類(lèi)分布合成的RNA類(lèi)型對(duì)α-鵝膏蕈堿的敏感性Ⅰ核仁rRNa不敏感Ⅱ核質(zhì)hnRNA低濃度敏感Ⅲ核質(zhì)tRNA，5sRNA高濃度敏感Mt線粒體線粒體RNAs不敏感

〔2〕轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動(dòng)子選擇階段RNA聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物封閉復(fù)合物DNA解鏈開(kāi)放復(fù)合物開(kāi)放復(fù)合物RNA聚合酶、DNA、新生RNA三元復(fù)合物真核生物此過(guò)程還要7種輔助因子。二、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始一〕識(shí)別轉(zhuǎn)錄是從DNA分子的特定部位開(kāi)始的，這個(gè)部位也是RNA聚合酶全酶結(jié)合的部信這就是啟動(dòng)子。為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動(dòng)子處結(jié)合呢？顯然啟動(dòng)子處的核苷酸序列具有特殊性，為了方便，人們將在DNA上開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基定為+1，沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用負(fù)值表示。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)原核行物的100多個(gè)啟動(dòng)子的序列進(jìn)行了比較后發(fā)現(xiàn)；在RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游大約-10bp和-35bp處有兩個(gè)保守的序列，在-10bp附近，有一組5’-TATAATpu的序列，這是Pribnow首先發(fā)現(xiàn)的稱(chēng)為Pribnow框，RNA聚合酶就結(jié)合在互部位上。-35bp附近，有一組5’-TTGACG-的序列；啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。不同的啟動(dòng)子序列有所不同，有一些共同的規(guī)律，它們一般長(zhǎng)40－60bp，含A堿基對(duì)較多，某些段落是很相似的，這些相似的保守性段落稱(chēng)為共有性序列。如下圖，啟動(dòng)子一般可分為識(shí)別(R)、結(jié)合(B)和起始(I)三個(gè)區(qū)段。轉(zhuǎn)錄起始第一個(gè)堿基(通常標(biāo)記位置為＋1)最常見(jiàn)的是A；在－10bp附近有TATAAT一組共有序列，稱(chēng)為Pribnow盒；在－35bp處又有TTGACA一組共有序列。典型的原核啟動(dòng)子有四大要素轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，-10區(qū)，-35區(qū)和-10區(qū)與-35區(qū)之間的間隔。原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：通常是嘌呤，其序列為CAT-10區(qū)：是一個(gè)6堿基保守序列〔常以-10為中心〕。T80A95t45A60A50T96，有助于DNA的解鏈。

-35區(qū)：是另一個(gè)6堿基保守序列〔常以-35為中心〕。T82T84G78A65C54a45由于RNA聚合酶分子很大，大約能覆蓋70bp的DNA序列，因此酶分子上的一個(gè)適合部位就能占據(jù)從-35到-10序列區(qū)域〔圖〕大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū)真核生物的啟動(dòng)子有其特殊性，真核生物有三種RNA聚合酶，每一咱都有自己的啟動(dòng)子類(lèi)型。以RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個(gè)真核生物RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子核苷酸序列伯發(fā)現(xiàn)；在-25區(qū)有TATA框，又稱(chēng)為Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列為T(mén)28A97A93A85A63T37A83A50T37，根本上都由A，T堿基所組成，離體轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的選擇，天然缺少TATA框的根本可以從一個(gè)以上的位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。在-75區(qū)有CAAT框，其一致的序列為GGTCAATCT。有實(shí)驗(yàn)說(shuō)明CAAT框與轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)，例如缺失GG，兔子的β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄效率只有原來(lái)的12%〔圖〕。真核基因啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子中的元件可以分為兩種：①核心啟動(dòng)子元件：指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游－25/－30bp處的TATA盒。核心元件單獨(dú)起作用時(shí)只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生根底水平的轉(zhuǎn)錄。②上游啟動(dòng)子元件：包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動(dòng)子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控。以人金屬硫蛋白基因?yàn)槔f(shuō)明真核基因上游啟動(dòng)子元件的組織情況和各元件相應(yīng)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。增強(qiáng)子及其功能除啟動(dòng)子外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游處還有一個(gè)稱(chēng)為增強(qiáng)子的序列，它能極大地增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，它的位置往往不固定，可存在于啟動(dòng)子上游或下游，對(duì)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)它們正向排列和反向排列均有效，對(duì)異源的基因也起到增強(qiáng)作用，但許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)它仍可能具有組織特異性，例如免疫球蛋白基因的增強(qiáng)子只有在B淋巴細(xì)胞內(nèi)活性最高，胰島素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增強(qiáng)子也都有很高的組織的特異性。增強(qiáng)子：是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。最早是在SV40病毒DNA中轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)上游約200bp發(fā)現(xiàn)有兩段72bp長(zhǎng)的重復(fù)序列，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍。其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100－200bp長(zhǎng)度，也和啟動(dòng)子一樣由假設(shè)干組件構(gòu)成，根本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。原核基因轉(zhuǎn)錄的起始原核生物轉(zhuǎn)錄起始可分為四個(gè)階段：

①核心酶在δ因子參與下接觸到DNA上；

②RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合，形成封閉性的起始復(fù)合物；

③酶結(jié)合在-10區(qū)，啟動(dòng)子活化；然后解開(kāi)雙鏈，暴露模板鏈；

④酶移動(dòng)到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，加上第一個(gè)核苷三磷酸，形成三元復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。轉(zhuǎn)錄起始動(dòng)畫(huà)〔二〕轉(zhuǎn)錄起始和延伸在原核生物中，當(dāng)RNA聚合酶的δ亞基發(fā)現(xiàn)其識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，全酶就與啟動(dòng)子的-35區(qū)序列結(jié)合形成一個(gè)封閉的啟動(dòng)子復(fù)合物。由于全酶分子較大，其另一端可在到-10區(qū)的序列，在某種作用下，整個(gè)酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部DNA12-17r的解鏈形成全酶和啟動(dòng)子的開(kāi)放性復(fù)合物。在開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物中起始位點(diǎn)和延長(zhǎng)位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿(mǎn)，在RNA聚合酶β亞基催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酯鍵。RNA合成的第一個(gè)核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見(jiàn)，此時(shí)δ因子從全酶解離下來(lái)，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動(dòng)，而脫落的δ因子與另一個(gè)核心酶結(jié)合成全酶反復(fù)利用。真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在所有的細(xì)胞中有一類(lèi)叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。真核生物基因中，有專(zhuān)門(mén)為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可大致分為二類(lèi)；第一類(lèi)為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開(kāi)始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子ⅡD。TFⅡD再與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的模式除TFⅡD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用，像TFⅡH就有旋轉(zhuǎn)酶活性，它可利用ATP分解產(chǎn)生的能量，介導(dǎo)起始點(diǎn)雙螺旋的翻開(kāi)，使RNA聚合酶得以發(fā)揮作用。從中也不難看出真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子DNA調(diào)控?zé)o件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的復(fù)雜體系。第二類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這此TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類(lèi)固醇激素，生長(zhǎng)因子或其它刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。RNA鏈的延長(zhǎng)RNA鏈的延長(zhǎng)靠核心酶的催化，在起始復(fù)合物上第一個(gè)GTP的核糖3’-OH上與DNA模板能配對(duì)的第二個(gè)三磷酸核苷起反響形成磷酸二酯鍵。聚合進(jìn)去的核苷酸又有核糖3’-OH游離，這樣就可按模板DNA的指引，一個(gè)接一個(gè)地延長(zhǎng)下去。因此RNA鏈的合成方面也是5’--3。由于DNA鏈與合成的RNA鏈具有反平行關(guān)系，所以RNA聚合酶是沿著DNA鏈3’--5’方向移動(dòng)。整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程是由同一個(gè)RNA聚合酶來(lái)完成的一個(gè)連續(xù)下斷的反響，轉(zhuǎn)錄本RNA生成后，暫時(shí)與DNA模板鏈形成DNA·RNA雜交體，長(zhǎng)度約為12個(gè)堿基對(duì)，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄泡轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段，原核生物與真核生物之間沒(méi)有太大差異。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)動(dòng)畫(huà)三、終止與抗終止轉(zhuǎn)錄是在DNA模板某一位置上停止的，人們比較了假設(shè)干原核生物RNA轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)附近的DNA序列，發(fā)現(xiàn)DNA模板上的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)有兩種情況，一類(lèi)是不依賴(lài)于蛋白質(zhì)因子而實(shí)現(xiàn)的終止作用，另一類(lèi)是依賴(lài)蛋白質(zhì)輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用，這種蛋白質(zhì)輔因子稱(chēng)為釋放因子，通常又稱(chēng)ρ因子。兩類(lèi)終止信號(hào)有共同的序列特征，在轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文結(jié)構(gòu)，回文序列是一段方向相反，堿基互補(bǔ)的序列，在這段互補(bǔ)序列之間由幾個(gè)堿基隔開(kāi)，不依賴(lài)ρ因子的終止序列中富含G·C堿基對(duì)，其下游6-8個(gè)A；而依賴(lài)ρ因子的終止序列中G·C堿基對(duì)含量較少，其少游也沒(méi)有因固定的特征，其轉(zhuǎn)錄生成的RNA可形成二級(jí)結(jié)構(gòu)即柄一嚕噗結(jié)構(gòu)，又稱(chēng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能與RNA聚合酶某種特定的空間結(jié)構(gòu)相嵌合，阻礙了RNA聚合酶進(jìn)一步發(fā)揮作用〔圖17-8〕。除DNA模板本身的終止信號(hào)外，在入噬菌體中，發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)有協(xié)助RNA聚合酶跨越終止部位的作用，叫做抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白，例如入噬菌體的N基因產(chǎn)物。原核生物轉(zhuǎn)錄作用的終止信號(hào)ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。

有人認(rèn)為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。終止過(guò)程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。1、依賴(lài)于ρ因子的終止當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)生一定時(shí)間的停頓，這時(shí)如果沒(méi)有ρ因子，轉(zhuǎn)錄將會(huì)繼續(xù)下去；只有當(dāng)ρ因子存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄才終止。2、不依賴(lài)于ρ因子的終止假設(shè)終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱(chēng)區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。

在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端局部出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。RNA產(chǎn)物具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和一段富含U的片段轉(zhuǎn)錄終止動(dòng)畫(huà)3、抗終止〔1〕破壞終止位點(diǎn)RNA的莖－環(huán)結(jié)構(gòu)：前提：轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄出的mRNA產(chǎn)物中串聯(lián)的某AA密碼子指導(dǎo)其相應(yīng)的蛋白質(zhì)合成。當(dāng)介質(zhì)中該AA濃度高時(shí)，對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA含量高。核糖體通過(guò)串聯(lián)的密碼子。mRNA形成正常二級(jí)結(jié)構(gòu)〔末端莖－環(huán)結(jié)構(gòu)〕使DDRP終止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)介質(zhì)中該AA濃度低時(shí)，缺乏對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA。核糖體滯留在串聯(lián)的密碼子上。mRNA不能形成正常二級(jí)結(jié)構(gòu)〔末端莖－環(huán)結(jié)構(gòu)破壞〕使DDRP終止繼續(xù)。〔2〕依賴(lài)于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄終止：噬菌體中N基因轉(zhuǎn)錄翻譯成的N蛋白質(zhì)，可與終止子附近的DNA位點(diǎn)〔該位點(diǎn)中含有A區(qū)即CGCTCTTA和一個(gè)二重對(duì)稱(chēng)序列〕結(jié)合，并需要寄主產(chǎn)生的幾種蛋白質(zhì)參與，使DDRP對(duì)終止信號(hào)不敏感，從而產(chǎn)生抗終止附：RNA的復(fù)制以DNA為模板合成RNA是生物界RNA合成的主要方式，但有些生物像某些病毒，噬菌體它們的遺傳信息貯存在RNA分子中，當(dāng)它們進(jìn)入宿細(xì)胞后，靠復(fù)制而傳代，它們?cè)赗NA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下合成RNA分子，當(dāng)以RNA模板時(shí)，在RNA復(fù)制酶作用下，按5'→3'方向合成互補(bǔ)的RNA分子,但RNA復(fù)制酶中缺乏校正功能,因此RNA復(fù)制時(shí)錯(cuò)誤率很高,這與反轉(zhuǎn)錄酶的特點(diǎn)相似.RNA復(fù)制酶只對(duì)病毒本身的RNA起作用,而不會(huì)作用于宿主細(xì)胞中的RNA分子。四、mRNA的特征與比較1、原核生物mRNA的特征〔1〕半衰期短〔2〕以多順?lè)醋拥男问酱嬖凇?〕5’端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3’端無(wú)或少poly〔A〕結(jié)構(gòu)2、真核生物mRNA的特征〔1〕半衰期較長(zhǎng)〔2〕幾乎都是單順?lè)醋拥男问健?〕5’端存在帽子結(jié)構(gòu)，大多數(shù)生物3’端有poly〔A〕尾巴結(jié)構(gòu)五、轉(zhuǎn)錄后修飾不管原核或真核生物的rRNAs都是以更為復(fù)雜的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA分子。然而絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時(shí)進(jìn)行的，隨著mRNA開(kāi)始的DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細(xì)胞的mRNA并無(wú)特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程，相反，真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上是分天的，剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA是分子很大的前體，即核內(nèi)不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的局部轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA，其余局部將在轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中被降解掉?！惨弧砿RNA的加工修飾原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順?lè)醋樱磶讉€(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動(dòng)子和共同終止信號(hào)經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過(guò)酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶。原核生物中沒(méi)有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開(kāi)始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒(méi)有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過(guò)程。真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順?lè)醋樱匆粋€(gè)mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對(duì)5’端和3’端的修飾以及對(duì)中間局部進(jìn)行剪接。1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5’端都有一個(gè)m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為甲基鳥(niǎo)苷的帽子。鳥(niǎo)苷通過(guò)5’-5’焦磷酸鍵與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的5’端相連。當(dāng)鳥(niǎo)苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時(shí)，此時(shí)形成的帽子被稱(chēng)為“帽0〞，如果附m7G-PPNmN外，這個(gè)核糖的第“2〞號(hào)碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱(chēng)為“帽1〞，如果5’末端N1和N2中的兩個(gè)核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱(chēng)為“帽2〞。真核生物mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNa做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對(duì)核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別提供了信號(hào)，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNa免遭5’外切核酸酶的攻擊。5’端加“G〞的反響是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化完成的，帽子結(jié)構(gòu)是GTP和原mRNA5’的三磷酸腺苷〔或鳥(niǎo)苷〕縮合反響的產(chǎn)物。mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化，由尿苷酸-7-甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)催化。帽子結(jié)構(gòu)的功能：①對(duì)翻譯起識(shí)別作用。②可以保護(hù)mRNA免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物mRNA都有5’端帽子結(jié)構(gòu)。2．在3’端加尾大多數(shù)的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴〔A)，多聚〔A)尾巴大約為200bp。多聚〔A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識(shí)別，mRNa的游離3’-OH端，并加上約200個(gè)A殘基。近年來(lái)，在大多數(shù)真核基因的3’一端有一個(gè)AATAA序列，這個(gè)序列是mRNa3’-端加polyA尾的信號(hào)。靠核酸酶在此信號(hào)下游10-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。有人推測(cè)polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量，的沒(méi)有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對(duì)真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。不連續(xù)基因：真核生物在編碼多肽鏈的核苷酸序列中間存在著與氨基酸編碼無(wú)關(guān)的DNA序列，即一個(gè)基因編碼序列被分隔成不連續(xù)的假設(shè)干區(qū)段，稱(chēng)為真核生物的不連續(xù)基因。不連續(xù)基因由外顯子和內(nèi)含子交替排列組成：外顯子：編碼蛋白質(zhì)的序列。內(nèi)含子：初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟mRNA時(shí)被切除的間隔序列。3.mRNA前體〔hnRNA〕的拼接

〔RNA內(nèi)含子的剪切〕內(nèi)含子的可能功能：①內(nèi)含子通過(guò)啟動(dòng)子、起始位點(diǎn)的堿基配對(duì)，可以阻止或增強(qiáng)RNA聚合酶的作用；②內(nèi)含子具有各種剪接信號(hào)，不同的細(xì)胞可以選擇不同的拼接點(diǎn)，對(duì)外顯子進(jìn)行有選擇地拼接，形成不同的成熟mRNA；③內(nèi)含子也許有自已特定的蛋白質(zhì)編碼。切除內(nèi)含子的過(guò)程稱(chēng)為RNA的剪接RNA的三種剪接方式：⑴自我剪接內(nèi)含子

能夠自發(fā)地進(jìn)行剪接，又分為Ⅰ型內(nèi)含子和Ⅱ型內(nèi)含子兩個(gè)亞類(lèi)。⑵由蛋白酶參與剪接的內(nèi)含子

主要在tRNA前體中發(fā)現(xiàn)。⑶由snRNP參與剪接的內(nèi)含子

存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)基因中?！彩裁词恰皊nRNP〞？在真核生物的細(xì)胞核中，含有大量的小分子RNA，在天然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白粒子形式存在，稱(chēng)為snRNP。〕原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個(gè)蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個(gè)插入片斷所隔開(kāi)，一個(gè)真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個(gè)基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個(gè)很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個(gè)內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過(guò)復(fù)雜的過(guò)程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段〔外顯子〕連接起來(lái)〔圖〕真核生物的結(jié)構(gòu)的基因中具有可表達(dá)活性的外顯子，也含有無(wú)表達(dá)活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是無(wú)意義的，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達(dá)調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細(xì)胞核中hnRNA進(jìn)行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各局部連接起來(lái)，而變?yōu)槌墒斓膍RNA，這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進(jìn)行剪接作用，例如α-干擾素基因，圖以卵清蛋白基因?yàn)槔?，介紹一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄及加工過(guò)程。卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過(guò)程圖中外顯示以1、2、3、4……表示，內(nèi)含子以A、B、C、D…表示〔1〕Ⅰ型內(nèi)含子的自我剪接四膜蟲(chóng)35SrRNA前體的剪接反響是Ⅰ型的典型代表。特點(diǎn)是需要鳥(niǎo)苷參與。〔2〕

Ⅱ型內(nèi)含子的自我剪接不需要鳥(niǎo)苷參與，而由其自身結(jié)構(gòu)決定。特點(diǎn)是形成套索內(nèi)含子。〔3〕核蛋白介導(dǎo)的剪接核mRNA前體的剪接機(jī)制：①U1snRNP結(jié)合于內(nèi)含子的5’端；②U2snRNP結(jié)合到內(nèi)含子的分支點(diǎn)上；③U5snRNP結(jié)合到內(nèi)含子的3’端，U4/U6snRNP結(jié)合于U5；④U1和U2結(jié)合，形成套索RNA結(jié)構(gòu)；⑤U4釋放，內(nèi)含子左側(cè)切斷，5’外顯子作為獨(dú)立片段釋放；⑥內(nèi)含子的3’剪接點(diǎn)切斷，形成套索內(nèi)含子，游離出來(lái)；⑦5’外顯子和3’外顯子連接形成成熟mRNA。mRNA前體拼機(jī)制

mRNA拼接反響需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱(chēng)為小核糖核蛋白顆粒，SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUAA順序高度互補(bǔ)，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來(lái)識(shí)別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過(guò)程，如下圖。真核生物mRNA前體在剪接過(guò)程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2’-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5’端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開(kāi)了外噗子1，而腺苷酸原來(lái)已有3’，5’--磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3’，5’-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3’-OH攻擊內(nèi)含子3’末端與外顯子2之間的3’，5’-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來(lái)，此時(shí)外顯子1和外顯子2可以連接起來(lái)〔圖〕。〔二〕rRNA轉(zhuǎn)錄后加工

原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：①rRNA前體被大腸桿菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定鏈長(zhǎng)的rRNA分子；②rRNA在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；③rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基〔見(jiàn)圖大腸桿菌rRNA前體的加工〕真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動(dòng)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨(dú)立于其他三種rRNA的基因轉(zhuǎn)錄〔圖:真核生物rRNA前體的加工)。真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經(jīng)過(guò)拼接反響。例如，四膜蟲(chóng)的rRNA前體的拼接是一種無(wú)酶催化的自動(dòng)拼接過(guò)程。四膜蟲(chóng)基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性方法，都不能破壞拼接活性，但反響中Mg2+和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進(jìn)行追蹤實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，起始過(guò)程是GTP在插入順序5’端發(fā)生親核反響，同時(shí)GMP與5’端切點(diǎn)的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開(kāi)。第二步是5’切點(diǎn)的外元3’-OH與3’切點(diǎn)的外元5’-P共價(jià)連接，獲得成熟的rRNA，被切除局部最后環(huán)化，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)從5’端去掉一個(gè)15核苷酸啐片。剩余局部連接成399核苷酸的環(huán)狀產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)幾步，最后切下一個(gè)19個(gè)核苷酸的線性?xún)?nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內(nèi)含子本身的催化性質(zhì)決定的〔圖四膜蟲(chóng)rRNA前體的自我剪接〕。從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征，例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個(gè)保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會(huì)使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們?cè)隗w外沒(méi)計(jì)并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實(shí)驗(yàn)中〔圖:錘頭結(jié)構(gòu)模式圖〕。〔三〕tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾原核生物和真核生物剛轉(zhuǎn)錄生成的tRNA前體一般無(wú)生物活性，需要進(jìn)行①剪切和拼接②堿基修飾③3’-OH連接-ACC結(jié)構(gòu)〔圖:tRNA前體的加工〕。①tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNaseP可特異剪切tRNA前體的5’旁順序，因此，該酶被稱(chēng)為tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個(gè)3’-核酸內(nèi)切酶，這可將tRNA前體3’端的一段核苷酸序列切下來(lái)。此外RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年來(lái)的研究說(shuō)明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白質(zhì)組成，最近發(fā)現(xiàn)RNAaseP分子中的RNA局部在某些條件下，可以單獨(dú)地催化tRNA前體的加工成熟，這個(gè)發(fā)現(xiàn)和四膜蟲(chóng)tRNA能自我拼接被認(rèn)為是近十年來(lái)生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一。說(shuō)明RNA分子確具有酶的催化活性。經(jīng)過(guò)剪切后的tRNA分子還要在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需的片段拼起來(lái)。②成熟的tRNA分子中有許多的稀有堿基，因此tRNA在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶復(fù)原為雙氫尿嘧啶。尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脫氨基為成為次黃嘌呤核苷酸〔Ⅰ〕③3’末端加上CCA：在核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，3’--末端除去個(gè)別堿基后，換上tRNA分子統(tǒng)一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂結(jié)構(gòu)。復(fù)習(xí)與作業(yè)題1、RNA轉(zhuǎn)錄主要包括哪幾個(gè)過(guò)程？主要作用原理是什么？2、RNA聚合酶的組成如何？其作用是什么？有哪些特點(diǎn)？3、簡(jiǎn)述原核生物與真核生的中的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能4、真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工包括哪些內(nèi)容？5、概念：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、DDRP、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、內(nèi)含子、核心酶KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMelXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTl#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%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