動(dòng)物細(xì)菌常見主要耐藥基因檢測技術(shù)

3動(dòng)物細(xì)菌常見主要耐藥基因檢測技術(shù)本文件規(guī)定了動(dòng)物細(xì)菌常見主要耐藥基因的PCR檢測技術(shù)要求。本文件適用于在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物細(xì)菌四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類及氯霉素類主要常見耐藥基因的檢測及gyrA、gyrB、parC和parE基因的突變分析。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào)病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T2025-2016動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室生物安全操作規(guī)范SN/T3640-2013出口食品中致瀉大腸桿菌檢測方法PCR法SN/T2206.12-2014化妝品微生物檢驗(yàn)方法第12部分：綠膿桿菌PCR法。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號(hào)（《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》）3術(shù)語和定義本文沒有需要界定的術(shù)語或定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對(duì)（basepair）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DNase：脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TE緩沖液：TE緩沖液（Tris-EDTAbuffersolution）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）5原理4根據(jù)動(dòng)物細(xì)菌tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（aac（3）-IV、aacC4、sul1、sul2、dfrA1、cmlA和cat1等常見的主要耐藥基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。6儀器和器材6.1高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（離心范圍0～20000r/min）6.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。6.3PCR擴(kuò)增儀6.5凝膠成像系統(tǒng)6.6微波爐6.7分析天平6.8離心管：15mL離心管、1.5mL離心管和0.2mLPCR專用離心管。6.9微量可調(diào)移液器：1000μL，200μL，100μL，50μL，20μL，10μL，2μL。7試劑和引物注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級(jí)均為不含DNA或DNase的分析純或生化試劑；所有試劑均用無菌的容器分裝。7.1DNA抽提試劑：DNAzol?Reagent，外觀為淡綠色，于4～8℃保存。7.2無水乙醇：-20℃預(yù)冷。7.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。7.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。7.5dNTP（2.5mmol/L）。7.6陰性對(duì)照：滅菌雙蒸水。7.7陽性對(duì)照：動(dòng)物細(xì)菌耐藥菌株。7.8無菌生理鹽水。7.9TE緩沖液（pH8.0）。7.10TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液。7.11溴化乙錠。7.12DL2000DNAMarker。用于PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L，其序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見附錄A。8操作步驟8.1菌懸液制備挑選37℃培養(yǎng)18～24h后的典型菌落，用1mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。8.2DNA提取58.2.1DNA的提取按照DNAzol?Reagent提取試劑說明書進(jìn)行，并設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照。8.2.2將800μLDNAzol加入1.5mL滅菌離心管中，然后分別加入被檢樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL，顛倒混勻后，4℃12000r/min離心10min。8.2.3然后吸取900μL上清液轉(zhuǎn)移至加入新的1.5mL滅菌離心管中，再加入500μL無水乙醇混勻，4℃12000r/min離心5min。8.2.4棄上清，加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min離心5min。重復(fù)洗2次。8.2.54000r/min離心10s，用微量移液器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。8.2.6加入20μLTE緩沖液或經(jīng)高壓處理的滅菌雙蒸水，輕柔混勻，溶解管壁上的DNA，冰上保存?zhèn)溆茫蝗粜栝L期保存應(yīng)放置-70℃冰箱?？梢圆捎闷渌刃NA提取方法或合法化商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行操作。8.3PCR檢測8.3.1PCR反應(yīng)體系建立25μL反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：——滅菌蒸餾水17.375μL——10×PCRBuffer2.5μL——2.5mmol/LdNTP2μL——ExTaqDNA聚合酶0.125μL——上游特異性PCR引物0.5μL——下游特異性PCR引物0.5μL——DNA模板2μL8.3.2PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火溫度根據(jù)引物進(jìn)行選擇（51℃、53℃、4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）板點(diǎn)樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。9試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定9.1試驗(yàn)成立條件9.1.1陰性對(duì)照陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。9.1.2陽性對(duì)照9.1.2.1tet（A）基因陽性對(duì)照出現(xiàn)577bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.2tet（B）基因陽性對(duì)照出現(xiàn)634bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.3tet（C）基因陽性對(duì)照出現(xiàn)223bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.4tet（M）基因陽性對(duì)照出現(xiàn)594bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.5gyrA基因陽性對(duì)照出現(xiàn)566bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.6gyrB基因陽性對(duì)照出現(xiàn)1116bp的擴(kuò)增條帶。69.1.2.7parC基因陽性對(duì)照出現(xiàn)334bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.8parE基因陽性對(duì)照出現(xiàn)488bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.9aac（6′）-Ib-cr基因陽性對(duì)照出現(xiàn)485bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.10aac（3）-IV基因陽性對(duì)照出現(xiàn)286bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.11aacC4基因陽性對(duì)照出現(xiàn)726bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.12sul1基因陽性對(duì)照出現(xiàn)822bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.13sul2基因陽性對(duì)照出現(xiàn)273bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.14dfrA1基因陽性對(duì)照出現(xiàn)367bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.15cmlA基因陽性對(duì)照出現(xiàn)698bp的擴(kuò)增條帶。9.1.2.16cat1基因陽性對(duì)照出現(xiàn)547bp的擴(kuò)增條帶。當(dāng)在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)符合以上條件時(shí)實(shí)驗(yàn)成立，否則實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。9.2結(jié)果判定在紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)成立時(shí)，如果被檢菌株出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可初步判斷被檢菌株攜帶相應(yīng)的耐藥基因，初步判斷為陽性結(jié)果的菌株可通過核酸序列測定進(jìn)行確認(rèn)及耐藥基因（gyrA、gyrB、parC、parE）的突變分析。如果被檢菌株未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可判斷被檢菌株未攜帶相應(yīng)的耐藥基因。10檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2-2004的規(guī)定執(zhí)行。11廢棄物處理按照GB19489-2008的規(guī)定執(zhí)行。附錄B（規(guī)范性附錄）附錄C引物動(dòng)物細(xì)菌常見耐藥基因的PCR引物℃tet（A）F5’-GGTTCACTCGAACGACGTCA-3’R5’-CTGTCCGACAAGTTGCATGA-3’tet（B）F5’-CCTCAGCTTCTCAACGCtet（C）F5’-TCAAGCCTTCGTCACTR5’-AAGCTGTCCCTGATGGTCGT-3’tet（M）F5’-GAGGTCCGTCTGAACR5’-AGAAAGGATTTGGCGaac（3）-IVR5’-TCATCTCGTTCTCCGparCR5’-TCGCTCAATAGCAGCTCG-3’parEF5’-TACCGAGCTGTTCCTgyrAR5’-ACTTCCGTCAGGTTGTGC-3’gyrBR5’-CGTCACGCTGCGGAATGT-3’Aac（6′R5’-CGAATGCCTGGCGTGTTT-3’aacC4F5’-GCTCATCGGTCAGCTF5’-CCGCCACGGTGTTGTTGR5’-CACCTTGCCTGCCCATCATTAG-3’F5’-CCGTCTCGCTCGACAR5’-CAAGGCGGTTGCGTTTGA-3’F5’-TTCGGCATTCTGAATR5’-ATGATCTAACCCTCGGTCTC-3’F5’-GGAGTGCCAAAGGTGAR5’-GAGGCGAAGTCTTGGGTF5’-AGTTGCTCAATGTACCTR5’-TTGTAATTCATTAAGCAT9附錄E（規(guī)范性附錄）附錄F試劑配制F.1電泳緩沖液（50倍）F.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水F.1.2TAE（三羥甲基氨基甲烷一乙酸）電泳緩沖液（50倍）80mL調(diào)pH至8.0加至100mL羥基甲基氨基甲烷（Tris分析純）冰乙酸0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用。24257.1加至1000gmLmLmLF.2TE緩沖液（pH8.0）F.2.11mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液取12.11gTris置于100mL燒杯中，加入80mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，冷卻至室溫后，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至100mL，121℃高壓15min，室溫保存。F.2.210倍TEBuffer取10mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液和0.5mol/L