第一章緒論(酶工程)

第一章緒論教學(xué)重點

:酶工程的概念、固定化酶活性測定、酶的生產(chǎn)方法。講授要點：1、酶工程概念

2、酶工程發(fā)展概況

3、酶的基本知識（復(fù)習(xí)）

4、酶的生產(chǎn)方法

一、酶工程(enzymeengineering)概念酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶工程又稱酶技術(shù)，是圍繞著酶所特有的生物催化性能使其在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和其他方面發(fā)揮作用的應(yīng)用技術(shù)，是酶學(xué)基本原理與化學(xué)工程技術(shù)、基因重組技術(shù)及微生物學(xué)技術(shù)有機結(jié)合的產(chǎn)物。第一節(jié)酶工程概念、研究內(nèi)容和主要任務(wù)二、酶工程的主要內(nèi)容包括：1、酶的生產(chǎn)和分離純化；2、酶分子改造與化學(xué)修飾、遺傳修飾；3、酶、細胞和原生質(zhì)體固定化；4、酶反應(yīng)器；5、酶的非水相催化；6、核酸酶、抗體酶的研究7、模擬酶、合成酶以及酶分子的人工設(shè)計、合成的研究8、酶的應(yīng)用。三、酶工程的主要任務(wù)

通過預(yù)先設(shè)計，經(jīng)過人工操作控制而大量所需的酶，并通過各種方法使酶發(fā)揮其最大的催化功能。對酶及生物催化劑的認(rèn)識的發(fā)展

……生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶（Enzyme）極端酶（extremozyme）抗體酶（abzyme）

生物工程酶核酸類：Ribozyme

模擬生物催化劑

克隆酶

遺傳修飾酶

蛋白質(zhì)工程新酶

采用生物體生產(chǎn)酶劑是從19世紀(jì)末開始的。

1894年，日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制備得到高峰淀粉酶，用作消化劑，開創(chuàng)了近代酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的先例。

1908年，德國的羅姆（Rohm)從動物胰臟中制得胰酶，用于皮革的軟化；

第二節(jié)

酶工程發(fā)展概況1908年，法國的波伊登制備得到細菌淀粉酶，應(yīng)用于紡織品的退漿；

1911年美國的華勒斯坦制成木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。此后，酶的生產(chǎn)和應(yīng)用逐步發(fā)展。

1949年，用液體深層培養(yǎng)法進行細菌α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕。50年代以后，隨著生化工程的發(fā)展，大多數(shù)酶制劑的生產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物液體深層發(fā)酵的方法。

1960年，法國的雅各和莫諾德提出操縱子學(xué)說，闡明了酶生物全面的調(diào)節(jié)機制。使酶的生物合成可以按照人們的意愿加以調(diào)節(jié)控制。通過酶的誘導(dǎo)和解除阻遏，可以顯著地提高酶的產(chǎn)量。

20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的動、植物細胞培養(yǎng)技術(shù)。植物細胞、動物細胞都可以如同微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，通過細胞的生命活動，得到人們所需的各種產(chǎn)物，其中包括各種酶。例如，通過植物細胞培養(yǎng)可以獲得超氧化物歧化酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、過氧化物酶、糖苷酶、糖化酶等。通過動物細胞培養(yǎng)可以獲得血纖維蛋白酶原活化劑、膠原酶等。

1953年，德國的格魯布霍費和施來斯首先將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等與上述載體結(jié)合，制成固定化酶。

1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。學(xué)者們開始用“酶工程”這個新名詞來代表有效地利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。1971年第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議在美國召開，當(dāng)時壓倒的主題是固定化酶。

此后，為了省去酶的分離純化過程，出現(xiàn)了固定化菌體（固定化死細胞）技術(shù)。

1973年日本在工業(yè)上成功地利用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有多種固定化酶用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。例如，利用固定化葡萄糖異構(gòu)酶由葡萄糖生產(chǎn)果葡糖漿；利用固定化青霉素?；干a(chǎn)半合成青霉素或頭孢霉素；利用固定化β-半乳糖苷酶生產(chǎn)低乳糖奶等。

在此基礎(chǔ)上，70年代后期，出現(xiàn)了固定化細胞（又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞）技術(shù)。固定化細胞是指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動（包括生長、增殖、新陳代謝）的細胞，可以反復(fù)或連續(xù)使用在發(fā)酵生產(chǎn)上。

1978年，日本的鈴木等人用固定化細胞生產(chǎn)α—淀粉酶研究成功。此后用固定化細胞生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、果膠酶等的研究蓬勃展開。然而，固定化細胞只能用于生產(chǎn)胞外酶等容易分泌到細胞外的產(chǎn)物。對于胞內(nèi)酶及其他胞內(nèi)產(chǎn)物的生產(chǎn)必須采用80年代中期才發(fā)展起來的固定化原生質(zhì)體技術(shù)。

1986年開始，華南理工大學(xué)生物工程研究所用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脫氫酶等的研究相繼取得成功，為胞內(nèi)酶的連續(xù)生產(chǎn)開辟了嶄新的途徑。

20世紀(jì)80年代以來，酶分子修飾技術(shù)發(fā)展很快，修飾的方法主要有：酶分子主鏈修飾，酶分子側(cè)鏈基團修飾，酶分子組成單位置換修飾，酶分子中金屬離子置換修飾和物理修飾等。通過酶分子修飾，可以提高酶活力，增加酶的穩(wěn)定性，消除或降低酶的抗原性等，尤其是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的蛋白質(zhì)工程，已把酶分子修飾與基因工程技術(shù)結(jié)合在一起。通過基因定位突變技術(shù)，可把酶分子修飾后的信息儲存于DNA之中，經(jīng)過基因克隆和表達，就可以通過生物合成的方法獲得具有新的特性和功能的酶。

1984年，克利巴諾夫（Klibanov)等人進行了有機介質(zhì)中酶的催化作用的研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酶在有機介質(zhì)中不但具有催化活性，而且還具有很高的穩(wěn)定性。改變了酶只能在水溶液中進行催化的傳統(tǒng)概念。與水溶液中酶的催化相比，酶在有機介質(zhì)中的催化具有提高非極性底物或產(chǎn)物的溶解度、進行在水溶液中無法進行的合成反應(yīng)、減少產(chǎn)物對酶的反饋抑制作用、提高手性化合物不對稱反應(yīng)的對映體選擇性等顯著特點。

近20多年來，在酶和細胞固定化技術(shù)發(fā)展的同時，其他的酶分子修飾技術(shù)也不斷發(fā)展。此外，核酶、抗體酶、酶的化學(xué)合成、人工模擬，以及各種酶的應(yīng)用技術(shù)的研究，使酶工程已經(jīng)成為生物工程的主要內(nèi)容。今后將不斷地向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。

一、酶作用的特點

極高的催化效率

高度的專一性

酶催化作用的條件溫和

酶活性可調(diào)控

有的酶需輔助因子第三節(jié)酶的基本知識（一）、酶的專一性酶催化作用的專一性是酶是最重要的特性之一，是酶與其他非酶催化劑的最主要的不同之處。酶的專一性是指一種酶只能催化一種或一類結(jié)構(gòu)相似的底物進行某種類型的反應(yīng)。

酶的專一性可以按其嚴(yán)格程度的不同，分為下列兩大類：1、結(jié)構(gòu)專一性

概念：酶對所催化的分子（底物，Substrate）化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇

類別：絕對專一性和相對專一性2、立體異構(gòu)專一性

概念：酶除了對底物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求外，對其立體異構(gòu)也有一定的要求

類別：旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性絕對專一性和相對專一性

絕對專一性

有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求非常嚴(yán)格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質(zhì)。

相對專一性有的酶對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求比上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。

1）鍵專一性有的酶只作用于一定的鍵，而對鍵兩端的基團并無嚴(yán)格要求。

2）基團專一性另一些酶，除要求作用于一定的鍵以外，對鍵兩端的基團還有一定要求，往往是對其中一個基團要求嚴(yán)格，對另一個基團則要求不嚴(yán)格。

鎖鑰學(xué)說：將酶的活性中心比喻作鎖孔，底物分子象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。

誘導(dǎo)契合學(xué)說：酶的活性中心在結(jié)構(gòu)上具柔性，底物接近活性中心時，可誘導(dǎo)酶蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，這樣就使使酶活性中心有關(guān)基團正確排列和定向，使之與底物成互補形狀有機的結(jié)合而催化反應(yīng)進行。3、有關(guān)酶專一性的學(xué)說酶專一性的“鎖鑰學(xué)說”

酶專一性的“誘導(dǎo)契合學(xué)說”4、酶的專一性的確定確定某種酶的專一性有好幾個步驟。（1）首先要選擇一種酶可催化的物質(zhì)作為該酶的作用底物，通過試驗確定其最適的pH值、溫度等反應(yīng)條件；（2）其次是試驗底物濃度對反應(yīng)速度的影響，確定其米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度；（3）然后用其他有可能是該酶作用底物的物質(zhì)，在相同的條件下逐個進行試驗，有時要在不同的條件下逐個試驗，觀察是否有催化反應(yīng)發(fā)生，從而確定該酶是屬于絕對專一性還是相對專一性。

（4）對于相對專一性的酶，可作用于一類物質(zhì)。可以選擇幾種有代表性的底物，求出各自的Km值。在某些情況下，不同的底物有不同的最適pH值，而pH值對Km有一定的影響。此時必須作出不同底物各自的pH曲線。然后再在各自的最適pH值條件下進行試驗，以確定各底物相應(yīng)的Km值。（5）在進行酶的專一性試驗時，所使用的酶和各種底物都要盡可能地純。對于有不對稱碳原子的物質(zhì)，應(yīng)分別對不同的光學(xué)異構(gòu)體進行試驗。（二）酶具有很高的催化效率酶的催化效率可比一般催化劑高106～1020倍。如：H2O2→H2O+O2H2O2酶為5×106

mol；Fe2+

為6×10-4

mol（三）反應(yīng)條件溫和，酶易變性失活（四）體內(nèi)酶活性是受調(diào)控的（五）酶的催化活性與輔基、輔酶和金屬離子有關(guān)E+SP+EES能量水平反應(yīng)過程

G

E1

E2酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。酶催化的中間產(chǎn)物理論二、酶催化機理1、鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)(proximityeffect)是指在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；

定向效應(yīng)(orientationeffect)是指酶的活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點。（二）底物形變（張力學(xué)說）

酶與底物結(jié)合，不僅使酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，同時也使底物分子發(fā)生扭曲變形，稱為應(yīng)變或形變效應(yīng)（straineffect)。這是由于酶與底物結(jié)合之后,一部分結(jié)合能被用來削弱底物分子中的敏感鍵,產(chǎn)生鍵扭變,有助于過渡態(tài)的形成,降低了底物反應(yīng)的活化能,從而使反應(yīng)速度大大加快。（三）、共價催化

某些酶分子的催化基團可以通過共價鍵與底物分子結(jié)合形成不穩(wěn)定的共價中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物極易變成過渡態(tài)，因而大大降低了活化能，使反應(yīng)速度大為提高。這種催化稱為共價催化（covalentcatalysis)。1、親核催化（nucleophiliccatalysis)是指酶活性中心的親核催化基團提供一對電子，與底物分子中的缺少電子具有部分正電荷的碳原子形成共價鍵，從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的共價中間物。酶分子中可作為親核基團2、親電子催化是指酶活性中心上的親電子催化基團從底物分子的親核原子上爭奪一對電子，形成共價鍵，從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的共價中間物。（四）、酸堿催化

在酶活性中心上，有些催化基團是酸催化基團向底物分子提供質(zhì)子；有些催化基團是堿催化基團從底物分子接受質(zhì)子。當(dāng)酸催化基團和堿催化基團共同發(fā)揮作用時，可以大大提高底物反應(yīng)速度，這種催化就稱為酸堿催化。His咪唑基就是許多酶的酸堿催化基團。酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團（五）活性部位疏水空穴的影響

已知某些化學(xué)反應(yīng)，在非極性（低介電常數(shù)）的介質(zhì)中，其反應(yīng)速度比在極性（高介電常數(shù)）介質(zhì)中快得多。酶分子的活性中心是位于非極性的空穴中的，因此，非極性的空穴有利于提高酶促底物反應(yīng)速度。與酶的高效率有關(guān)的主要因素——“鄰近”和定向效應(yīng)——張力學(xué)說——共價催化——酸堿催化——微環(huán)境影響三、影響酶催化作用的因素（一）底物濃度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系

Michaelis&Menten

于1913年推導(dǎo)出了上述矩形雙曲線的數(shù)學(xué)表達式，即著名的米氏方程。

Vmax

?［Ｓ］ｖ＝

Ｋｍ＋［Ｓ］

米氏常數(shù)的意義（1）當(dāng)ν=Vmax/2時，Km=[S]。因此，Km等于酶促反應(yīng)速度達最大值一半時的底物濃度。

（2）Km可以反映酶與底物親和力的大小Km越小，酶與底物的親和力越大。（3）可用于判斷反應(yīng)級數(shù)：當(dāng)[S]<0.01Km時，反應(yīng)為一級反應(yīng)；當(dāng)[S]>100Km時，ν=Vmax，反應(yīng)為零級反應(yīng).（4）.

Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）的Km值，來判斷是否為不同的酶。（5）.Km可用來判斷酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在時，通過測定酶在不同底物存在時的Km值，Km值最小者，即為該酶的最適底物。（二）、抑制劑對反應(yīng)速度的影響

凡是能降低酶促反應(yīng)速度，但不引起酶分子變性失活的物質(zhì)統(tǒng)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。

按照抑制劑的抑制作用，可將其分為不可逆抑制作用(irreversibleinhibition)和可逆抑制作用(reversibleinhibition)兩大類。

1、可逆抑制作用：

抑制劑以非共價鍵與酶分子可逆性結(jié)合造成酶活性的抑制，且可采用透析等簡單方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復(fù)的抑制作用就是可逆抑制作用。

可逆抑制作用包括競爭性和非競爭性抑制兩種類型。

競爭性抑制的速度方程與圖形特征

競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征

競爭性抑制的特點：⑴競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；⑵抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減小；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。

非競爭性抑制作用：抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。

非競爭性抑制的速度方程與圖形特征非競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征非競爭性抑制的特點：⑴非競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；⑷

動力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。

競爭性抑制作用非競爭性抑制作用競爭性非競爭性抑制作用機理示意圖底物與酶專一性結(jié)合2、不可逆抑制作用

抑制劑與酶分子的必需基團共價結(jié)合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡單方法使酶活性恢復(fù)的抑制作用就是不可逆抑制作用。酶的不可逆抑制作用（如有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制和重金屬、碘乙酰胺對巰基酶的抑制）。

專一性不可逆抑制劑

這類抑制劑選擇性很強，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。實例：有機磷殺蟲劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX非專一性不可逆抑制劑

抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團，這些基團中包含了必需基團，因而引起酶失活。類型：（三）、激活劑對反應(yīng)速度的影響

能夠促使酶促反應(yīng)速度加快的物質(zhì)稱為酶的激活劑。酶的激活劑大多數(shù)是無機離子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。

（四）、酶濃度對反應(yīng)速度的影響

當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即ν=k[E]。（五）、溫度對反應(yīng)速度的影響

一般來說，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快。但當(dāng)溫度增加達到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降，直到完全失活。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達到一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。

溫度對酶促反應(yīng)速度的影響（六）、溶液pH對反應(yīng)速度的影響

觀察pH對酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一“鐘形”曲線，即pH過高或過低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的pH值就稱為酶的最適pH。

pH對酶促反應(yīng)速度的影響

人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH在6.5～8.0之間。酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)。

pH對酶促反應(yīng)速度的影響，其原因主要是由于pH的改變導(dǎo)致了酶的催化基團以及底物分子的解離狀態(tài)改變或者導(dǎo)致了酶蛋白的變性。

四、酶的活力測定在酶的生產(chǎn)及應(yīng)用過程中，經(jīng)常要進行酶的活力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。

酶活力是指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)速度。反應(yīng)速度越大，意味著酶活力越高。

酶催化反應(yīng)速度，用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示。即：V=S/t或P/t

1、酶活力測定方法酶活力測定方法多種多樣?？偟囊笫强焖?、簡便、準(zhǔn)確。酶活力測定均包括兩個階段。首先要在一定的條件下，酶與其作用底物反應(yīng)一段時間，然后再測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物變化的量。一般采取如下步驟：（1）根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。（2）根據(jù)酶的動力學(xué)性質(zhì)，確定酶促反應(yīng)的溫度，pH值、底物濃度、激活劑濃度等條件。（3）在一定條件下，將一定量的酶液與底物溶液混合均勻，適時記下反應(yīng)開始的時間。（4）反應(yīng)到一定的時間，取出適量的反應(yīng)液運用各種生化檢測技術(shù)，測定產(chǎn)物的生產(chǎn)量或底物的減少量。為了準(zhǔn)確地反映酶促反應(yīng)的結(jié)果，應(yīng)盡量采用快速、簡便的方法，立即測出結(jié)果。若不能立即測出結(jié)果的，則要及時終止酶反應(yīng)，然后再測定。終止酶反應(yīng)的方法很多，常用的有：①反應(yīng)時間一到，立即取出適量的反應(yīng)液，置于沸水浴中，加熱使酶失活；②立即加入適宜的酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變性失活；③加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液的pH值迅速遠離酶催化反應(yīng)的最適pH，從而終止反應(yīng)；④將取出的反應(yīng)液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應(yīng)液的溫度迅速降低至100C以下等等。

測定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量，可采用光學(xué)檢測法，化學(xué)檢測法等生化檢測技術(shù)。例如，用分光光度法測定堿性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的對硝基酚的量；用化學(xué)滴定法測定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。一種酶可能有多種測定方法，要根據(jù)實際情況選用。

2、酶活力單位活力單位（activeunit）

習(xí)慣單位（U）:底物(或產(chǎn)物)變化量/

單位時間國際單位（IU）:1μmoL變化量/

分鐘

Katal（Kat）：1moL變化量/

秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小量度酶純度比活力（specificactivity）3.固定化酶的活力測定

與水不溶性載體結(jié)合，在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用的酶稱為固定化酶。固定化酶的性質(zhì)與游離酶有一些區(qū)別。所以固定化酶的活力測定與游離酶活力測定方法也有一些不同。常用的固定化酶測定方法：（1）振蕩測定：稱取一定重量的固定化酶，放在一定形狀，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液,在特定的條件下,一邊振蕩或攪拌,一邊進行催化反應(yīng)，經(jīng)過一定時間，取出一定量的反應(yīng)液進行測定。固定化酶反應(yīng)液的測定方法與游離酶反應(yīng)液的測定方法完全相同，振蕩或攪拌速度對反應(yīng)速度有很大影響。過大過小都對反應(yīng)速度有明顯影響。所以，在測定固定化酶的活力時，要在一定的振蕩或攪拌速度下進行。

（2）柱法測定：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中，讓底物溶液以一定的速度流過酶柱，收集流出的反應(yīng)液。按常規(guī)方法測定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量。測定方法與游離酶反應(yīng)液的測定方法相同。但在測定固定化酶活力要在固定的流速條件下進行。而且酶柱的形狀和徑高比都對反應(yīng)速度有明顯影響。所有這些條件都必須固定不變。（3）連續(xù)測定法：利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應(yīng)液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。測定時，可將振蕩反應(yīng)器中的反應(yīng)液連續(xù)引起連續(xù)測定儀（例如，雙束紫外光分光光度計等）的流動比色杯中進行連續(xù)分光測定。或者使固定化酶流出的反應(yīng)液連續(xù)流經(jīng)流動比色杯進行連續(xù)分光測定。酶活力的連續(xù)測定，可以及時并準(zhǔn)確地知道某一時刻的酶活力變化情況，對利用固定化酶進行連續(xù)生產(chǎn)和自動控制有重大意義，這方面正在不斷地研究發(fā)展之中。（4）

固定化酶的比活力測定：游離酶的比活力可以用每1ml酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)表示。在固定化酶中，一般要采用每1mg干固定化酶所具有的酶活力單位數(shù)表示，即為[單位/mg干固定化酶]。為此，測定固定化酶比活力時，首先用濕固定化酶測定其酶活力，然后將固定化酶在一定條件下干燥，稱取一定量的干重，然后計算兩者的商,才得到固定化酶的比活力。也可稱取一定量的干固定化酶，讓它在一定條件下充分溶漲后進行固定化酶活力測定，再計算比活力。對于酶膜，酶板或酶管等固定化酶，其比活力則以單位面積的活力單位表示。即為[酶活力（單位）/cm2]。（5）酶結(jié)合效率與酶活力回收率的測定：將一定量的酶進行固定化時，不是全部都成為固定化酶，而總是有一部分酶沒有與載體結(jié)合在一起。為了確定固定化的效果，需要測定酶的結(jié)合效率或酶活力回收率。

酶結(jié)合效率一般由加入的總酶活力減去未結(jié)合的酶活力的差值與加入的酶活力的百分比來表示。未結(jié)合酶活力，包括固定化后濾出固定化酶后的濾液以及洗滌固定化酶的洗滌液中所含有的酶活力的和。

酶活力回收率是指固定化酶的總活力與用于固定化酶總活力的百分比。當(dāng)固定化方法對酶活力沒有明顯影響時，酶結(jié)合效率與酶活力回收率的數(shù)值相近。然后固定化方法往往對酶活力有一定影響，兩者的數(shù)值往往有較大的差別。所以，通常都通過測定酶結(jié)合效率來表示固定化的效果。（6）相對酶活力測定：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力。固定化酶的相對酶活力與載體結(jié)構(gòu)，顆粒大小，底物分子量大小及酶結(jié)合效率等有密切關(guān)系。相對酶活力的高低表明了固定化酶應(yīng)用價值的大小。故此，在固定化酶的研制過程中，應(yīng)從固定化載體，固定化技術(shù)等方面進行研究和改進，以提高固定化酶的相對酶活力。

第四節(jié)

酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)是指經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作控制而獲得所需的酶的過程。酶的生產(chǎn)方法可分為提取法、發(fā)酵法以及化學(xué)合成法等3種。其中，提取法是最早采用而沿用至今的方法，發(fā)酵法是50年代以來酶生產(chǎn)的主要方法。而化學(xué)合成法仍在實驗室階段。一、提取分離法提取分離法是指將酶從細胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得符合研究或使用要求的酶制品的過程。提取法分離法是最早采用的酶生產(chǎn)方法。酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱為酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)果和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇８鶕?jù)酶提取時所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等方法。

酶的分離純化是采用各種生化分離技術(shù)使酶與各種雜質(zhì)分離，達到所需的純度，以滿足使用的要求。酶的分離純化方法主要有：

1、沉淀分離（1）鹽析沉淀法（2）等電點沉淀法（3）有機溶劑沉淀法（4）復(fù)合沉淀法（5）選擇性變性沉淀法

2、離心分離

3、過濾與膜分離

4、層析分離（1）吸附層析（2）分配層析（3）離子交換層析（4）凝膠層析（5）親和層析（6）層析聚焦

5、電泳分離（1）紙電泳（2）薄層電泳（3）薄膜電泳（4）凝膠電泳（5）等電點聚焦電泳6、萃取分離（1）有機溶劑萃取（2）雙水相萃?。?）超臨界萃取（4）反膠束萃取7、結(jié)晶（1）鹽析結(jié)晶法（2）有機溶劑結(jié)晶法（3）透析平衡結(jié)晶法（4）等電點結(jié)晶法8、濃縮與干燥選用酶的分離純化的要點：

1、目標(biāo)酶分子特性及其他物理化學(xué)性質(zhì)；2、酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異；3、酶的使用目的和要求；4、技術(shù)實施的難易程度；5、分離成本的高低；6、是否會造成環(huán)境污染等

從動物、植物或微生物的組織、細胞中提取分離所需的酶，至今仍然使用。例如，從動物胰臟中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶或這些酶的混合物——胰酶；從動物胃中提取胃蛋白酶；從動物小腸中提取堿性磷酸酶；從木瓜中提取木瓜蛋白酶；從菠蘿中提取菠蘿蛋白酶；從檸檬酸發(fā)酵的廢菌體——黑曲霉菌體中提取果膠酶等。酶的分離提取技術(shù)不但在酶的提取分離法生產(chǎn)中使用，而且在采用其他生產(chǎn)方法生產(chǎn)酶的過程中也是不可缺少的技術(shù)，此外，在酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機制、酶催化動力學(xué)等酶學(xué)研究方面也是不可缺少的重要手段。二、生物合成法生物合成法是50年代以來酶生產(chǎn)的主要方法。它是利用微生物細胞、植物細胞或動物細胞的生命活動而獲得人們所需酶的技術(shù)過程。

生物合成法產(chǎn)酶程序1、經(jīng)過篩選、誘變、細胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶細胞；2、在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進行細胞培養(yǎng)，通過細胞內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝作用，生成各種代謝產(chǎn)物。3、再經(jīng)過分離純化得到所需的酶。經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物細胞的生命活動合成所需酶的方法又稱為發(fā)酵法，根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，發(fā)酵法可分為固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵和固定化原生質(zhì)體發(fā)酵等。

固體培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基,以麩皮、米糠為原料，加入其他必要的營養(yǎng)成分，制成固體或半固體的麩曲，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種菌株后在一定條件下進行發(fā)酵，已獲得所需的酶。

其優(yōu)點是：設(shè)備簡單，操作方便，麩曲中酶的濃度較高，特別適合各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。其缺點是勞動強度較大，原料利用率較低，生產(chǎn)周期較長。

現(xiàn)在普遍使用的是液體深層發(fā)酵技術(shù)。是置于生物反應(yīng)器中，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶細胞，在一定條件下，進行發(fā)酵，生產(chǎn)所需的酶。例如，利用枯草桿菌細胞生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶，利用黑曲霉生產(chǎn)糖化酶、果膠酶，利用大腸桿菌生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、多核苷酸聚合酶等。其特點是：機械化程度較高，技術(shù)管理較嚴(yán)格，酶的產(chǎn)率較高，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高。用固定化細胞生產(chǎn)胞外酶。固定化細胞是指固定在水不溶性的載體上，在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。例如，固定化枯草桿菌細胞生產(chǎn)α–淀粉酶，固定化黑曲霉細胞生產(chǎn)糖化酶、果膠酶等。其特點是：1、細胞密度大，可提高產(chǎn)酶能力；2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間；3、細胞固定在載體上，流失較少，可以在高稀釋率的條件下連續(xù)發(fā)酵，利于自動化生產(chǎn)；4、發(fā)