免疫組化技術免疫組化在腫瘤病理診斷中的應用

免疫組織化學技術西南醫(yī)院病理學研討所馮俊明免疫組織化學〔簡稱免疫組化〕是組織化學的一種，它是利用知的特異性抗體或抗原能特異性結合的特點，經過化學反響使標志于結合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等，顯示一定的顏色，并借助顯微鏡察看其顏色的變化，從而在抗原抗體結合部位確定組織、細胞構造的化學成份或化學性質。近十年來，免疫組化技術開展很快，在現代醫(yī)學的根底和臨床研討中發(fā)揚著重要的作用，對疾病，尤其是對腫瘤的診斷、鑒別診斷及發(fā)病機理的研討提供了強有力的手段，但隨著免疫組化標志物的增多和利用，原為特異的標志物并非絕對特異，而且出現交叉反響和異常表達的情況日益增多。故對免疫組化標志結果的意義不能絕對化，應在光鏡察看組織形狀的根底上，合理運用免疫組化技術，謹慎判別其標志的意義。免疫組化標志的形狀學特征免疫組化標志具有形狀學特點，假設能熟練掌握那么有助于對免疫組化標志結果的正確判別，現擇要分述如下：一、陽性標志色度特征免疫組化標志時細胞陽性著色程度取決于抗原含量、分布密度和標志方法及其敏感性。普通而言，抗原含量越多，分布密度越高，標志方法越敏感，陽性結果顯色那么越強。根據陽性標志的顯色程度分為：淡黃色，提示為弱陽性；棕黃色，為中等度陽性；棕黑色，示為強陽性。在結果判別中，后兩者較有意義，可作為判別根據。而前者除思索標本處置和方法學要素外，能夠與細胞只需輕度異常表達，或某些細胞攝取了周圍組織抗原之故。二、陽性標志細胞學特征免疫組化標志中，陽性標志細胞學特征是反映抗原在細胞中的定位和分布情況。在診斷中陽性細胞以擬標志的細胞為前提，陽性表達必需在細胞特定的抗原部位，假設不在抗原所在部位的陽性表達和非目的細胞即使陽性也不應作為判別根據。根據抗原在細胞中分布和陽性顆粒沉淀部位可分為以下5種類型：1.胞膜型陽性顆粒主要分布于細胞膜外表，構成一薄層棕黃色顆粒包繞整個細胞。此類型常見于某些膜抗原，如上皮膜抗原〔EMA〕、白細胞共同抗原〔LCA〕及B細胞、T細胞、粒細胞相關抗原〔GAA〕和Ki-1等。2.胞核型陽性顆粒定位于細胞核，呈均勻分布或位于核膜下，有的呈小斑塊狀不規(guī)那么分布。此多見于增殖細胞核抗原、Ki-67及激素受體中雌激素受體〔ER〕、孕激素受體〔PR〕和基因p53等。3.胞漿型陽性顆粒主要分布于細胞漿。大部分抗原均屬于此種類型，如細胞角蛋白、波形蛋白、結蛋白、神經絲蛋白、肌紅蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特異性抗原〔PSA〕等。根據抗原在胞漿內分布方式，通常表現為彌漫性分布或局限性分布。前者陽性顆粒彌漫而均勻地分布于整個細胞漿。局限性是指陽性顆粒呈小斑點狀或斑塊狀局限于細胞漿中的某一部位、核周或細胞漿的一側。4.微絨毛型抗原顆粒主要分布于腺癌細胞的微絨毛，而胞漿和胞膜可以是陽性或陰性表達。這種表現方式最常見于各種腺癌，如甲狀腺腺癌、乳腺腺癌、胃腸腺癌、膽道腺癌、卵巢漿液性腺癌等。其特點是陽性顆粒除接近腔面陽性外，其他基底部可呈陰性反響。在腫瘤標志物中多見于上皮膜抗原、上皮特異性抗原、結腸相關抗原、卵巢癌抗原等。甲狀腺腺癌中甲狀腺球蛋白常以該方式出現。5.復合型在常規(guī)免疫組化標志中，同一種抗原可以同時表達于胞膜和胞漿、胞核和胞漿、微絨毛和胞漿，但很少發(fā)現胞膜和胞核同時表達。值得留意的是組織標本固定不及時呵斥抗原移位或乳腺ER和PR修復不充分也可以發(fā)生胞核和胞漿同時陽性。三、陽性標志組織學特征根據免疫組化陽性細胞的組織學特點，免疫組化陽性細胞或陽性顆?？沙室韵骂愋完惲校?.局灶型陽性細胞呈不規(guī)那么小灶性分布。陽性細胞可多可少，陳列不規(guī)那么，無固定陳列方式，陽性染色深淺不一。細胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鱗狀細胞癌、腺癌和癌肉瘤；肌動蛋白和結蛋白在低分化橫紋肌肉瘤；NSE、神經絲蛋白、突觸素在惡性神經內分泌腫瘤及低分化星形膠質細胞瘤中膠質原纖維酸性蛋白〔GFAP〕和惡性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表現為局灶性陽性。2.彌漫型陽性細胞呈彌漫性分布，細胞間無銜接，也可以單個細胞散在分布。此型中細胞幾乎都高度表達某種抗原，如淋巴瘤〔白細胞共同抗原〕、Hodgkin病〔粒細胞相關抗原、Ki-1〕、胃腸未分化癌癌胚抗原〔CEA〕及上皮膜抗原、尤文瘤中CD99等。3.片塊型較常見。陽性細胞多為細胞漿表達，細胞間界限較明晰，但相互交融呈片狀或團塊狀構造。此型可見于上皮源性腫瘤、某些向上皮分化的間葉源性腫瘤、惡性黑色素瘤、中分化神經內分泌瘤及核形細胞瘤〔如癌肉瘤和神經纖維瘤、平滑肌肉瘤〕。4.網狀型此型主要見于細胞密度較大的大細胞腫瘤，標志物多為膜抗原。陽性細胞膜與膜間相互緊靠，而胞核呈陰性反響，免疫組化標志顯示網狀構造。5.腺管型主要見于腺癌和具有腺癌樣構造的胚胎性腫瘤。上皮標志物多為胞漿表達。胃腸低分化腺癌中有時HE很難鑒別腺樣構造，但用癌胚抗原、上皮膜抗原或結腸癌相關抗原那么容易顯示出來。6.腔緣型陽性顆粒主要位于腺癌腔緣的微絨毛處，沿腺管腔緣外表內襯一薄層黃色顆粒，基底部多為陰性。結腸癌相關抗原在胃腸腺癌、膽囊腺癌、乳腺癌中常表現為這種類型；卵巢癌相關抗原在卵巢漿液性腺癌亦是如此；腫瘤相關粘液抗原在許多腺癌中也顯示腔緣陽性。7.菊團型陽性腫瘤細胞陳列呈菊團樣構造，部分陽性細胞圍繞血管陳列。此型多見于分化較好的神經內分泌腫瘤和膠質細胞瘤等，陽性顆粒定位在細胞漿。四、陽性標志強度特征細胞免疫組化標志的陽性強度根據顯色程度分為弱陽性、中度陽性和強陽性；也可根據陽性細胞在細胞中所占比例大致分為：弱陽性，陽性細胞≤25%；中陽性，陽性細胞25%~50%；強陽性，陽性細胞>50%。五、非特異著色特征以下情況可干擾免疫組化標志結果的察看和判別：〔1〕抗體交叉反響：是由于該抗原決議簇同時存在于多種組織細胞，如GFAP可同時存在于星形膠質細胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白那么更為嚴重，可表達于多種組織細胞。因此，應全面了解和認識該抗體的功能和標志范圍。故抗體交叉反響只需運用得當仍有助于診斷?！?〕腫瘤細胞異常表達：可選用多種標志去證明或排除，鑒別其真正組織來源或向某一組織細胞分化。〔3〕腫瘤細胞吞噬組織抗原：是由于某些惡性腫瘤細胞攝入周圍正常組織細胞成分，雖然后者也存在某些抗原，但不屬于瘤細胞固有成分，胞漿內抗原定位較模糊，因此應該區(qū)別?！?〕非特異性染色是指抗原無明確定位，腫瘤細胞與間質細胞、細胞與間質均為黃色，相互累及一片，色度無深淺之分。這種標志組織片不能作為免疫組織標志結果判別根據。非特異性染色的緣由常為組織標本固定不佳、抗體質量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，如前所述，陽性顆粒應位于細胞胞膜、胞漿或胞核，陽性細胞與陰性細胞相互交雜，陽性染色強度深淺不一。假設缺乏細胞間的不均一性染色，即是呈陽性染色，常提示為非特異性染色。另組織片邊緣反響和出血壞死灶周圍陽性反響不能作為診斷根據。免疫組化結果的判別原那么及

對假陰性和假陽性的認識一、免疫組化結果的判別原那么免疫組化具有特異性強、敏感性高及定位正確等優(yōu)點，但隨著免疫組化運用的普及和深化，越來越多的問題也隨之出現。因此，掌握對免疫組化結果的判別原那么是很重要的。1.必需設染色對照每批染色都要以特異性的陽性對照和陰性對照為根底，才干對染色結果做出正確的判別。沒有陽性對照，就不能做出真正陰性結果的判別；同理，沒有陰性對照，也就不能做出真正陽性結果的判別。因此，沒有對照的免疫組化染色，即使做出了判別也是不可信的。2.抗原表達必需在特定部位陽性表達必需在細胞和組織特定的抗原部位才干視為陽性，如LCA在細胞膜上、Keratin在細胞漿內、S-100蛋白在胞漿和胞核內，EMA在細胞膜上。不在抗原所在部位的陽性表達一概不能視為陽性。3.陰性結果不能視為抗原不表達即陰性結果不能以為具有否認意義；陽性表達有強弱、多少之分，哪怕是只是有少數細胞陽性〔但要在抗原所在部位〕也要視為陽性表達，不能以為個別細胞陽性而不作陽性對待。4.免疫組化與HE切片診斷應以HE切片診斷為準當免疫組化診斷結果與HE切片診斷不一致時，應再結合臨床資料、X線等影像學及實驗室結果綜合分析，不能用免疫組化檢查結果推翻HE切片診斷。二、引起假陰性和假陽性結果的緣由1.假陰性結果的緣由主要是：〔1〕抗體已失活或濃度不當或抗體本身達不到應有的敏感度；〔2〕由于組織自溶，抗原分散而導致抗原消逝，特別在長期固定的標本中因抗原漏出而致假陰性，因此應多用新穎固定之標本；〔3〕操作步驟不當，如反響時間不夠或過久、洗脫不夠或溫度過高；〔4〕組織或細胞中抗原的含量很低，所用的方法難以檢測到，如用直接法檢測為陰性，但改用間接法時那么為陽性。2.假陽性結果的主要緣由是：〔1〕所用的抗體與其它無關的抗原有交叉反響，特異性差，特別在運用多克隆抗血清時更易出現；〔2〕所用抗體濃度過高或染色過程中切片枯燥導致抗體與組織產生非特異性結合；〔3〕組織或細胞中有內源性過氧化物酶、堿性磷酸酶及生物素等產生非特異性顯色；免疫組化操作閱歷和領會操作中應留意以下問題：1.石蠟切片和冰凍切片均可，但要留意防止脫片。2.消除內源性過氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗滌要充分。4.要設陰性和陽性對照。5.顯色留意底物要適量、時間要嚴厲控制。6.消除內源性生物素活性：預先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC復合物應在臨用前30min配置。8.ABC試劑保管溫度以4℃為佳，保管達數年仍可獲稱心效果。9.抗體保管：-20℃分裝凍存，或于4℃常規(guī)運用，切忌反復凍融?！惨弧尘鶆虻谋尘叭旧?.酶-底物反響時間過長。2.在孵育中切片枯燥。3.一抗或二抗稀釋度不夠。4.切片洗滌不充分。5.封鎖所用的正常血清不對。免疫組化常遇問題〔二〕部分區(qū)域背景著色1.切片部分區(qū)域枯燥。2.顯色反響物在封片介質中是可溶的，呵斥彌散?！踩巢糠謪^(qū)域不著色1.脫蠟不完全。2.切片部分區(qū)域枯燥?！菜摹掣鞣N孵育結果一切抗體均不著色1.H2O2終濃度不夠或存放過久失效。2.稀釋液中有錯誤的正常血清〔如豬抗兔酶標抗體稀釋液中有正常兔血清〕。3.顯色反響物溶于脫水的酒精、二甲苯或封片液中?！参濉衬承┛贵w不著色1.需求消化而沒有消化。2.封鎖內源酶時使抗體活性下降。3.切片在裱片或枯燥時過熱。4.抗體過度稀釋，一抗?jié)舛刃∮诙埂?.抗體過期或頻繁凍融.〔六〕內源性酶活性：H2O2-甲醇封鎖不恰當?！财摺趁撈?.切片無粘附試劑。2.切片不干凈。3.冰凍切片：組織在貼片前曾經充分固定?！舶恕澈溯喞：?.切片已枯燥〔特別是冰凍切片〕。