實驗四-new細胞培養(yǎng)用液的配制

實驗四、細胞培養(yǎng)使用液的配制2/2/2024一、實驗原理：細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)條件體外培養(yǎng)細胞所需營養(yǎng)物質與體內根本相同，但需求的量與代謝方式與體內細胞不盡相同2/2/20241.細胞培養(yǎng)所需根本物質〔1〕水〔2〕無機鹽〔3〕糖類〔4〕氨基酸〔5〕維生素〔6〕促生長因子2/2/2024糖類---葡萄糖細胞的主要營養(yǎng)物質，為生命活動提供能量。與蛋白質和脂類共同構成結構材料和生物活性物質。體外培養(yǎng)動物細胞時，常以葡萄糖作為能源材料，根據不同細胞的代謝特點，所加葡萄糖濃度有所不同。植物細胞培養(yǎng)一般以蔗糖作為能源物質。2/2/2024氨基酸常需要以下12種氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸

另外所有細胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促進氨基酸進入細胞膜，參與核酸合成，也是能源和碳源。

2/2/20242.培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液包括：培養(yǎng)液〔基〕、緩沖液、平衡鹽溶液、血清及消化液、pH調節(jié)液和抗生素等。

〔1〕水與平衡鹽溶液體外培養(yǎng)的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。最低質量要求為電阻率在1X106?以上。

2/2/2024常用的平衡鹽溶液有HanksBSS，EarleBSS等注意：一些BSS含有Ca2+、Mg2+，它們是細胞膜的重要組成成分，又參與許多細胞功能活動，但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時，宜采用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液或PBS。2/2/2024〔2〕培養(yǎng)基培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基常用的天然培養(yǎng)基有血清、血漿、水解乳蛋白和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕、鼠尾膠原等。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜。易發(fā)生支原體污染2/2/2024血漿:雞血漿的使用較早，含有多種化學物質，其中包括：水(91%)、蛋白質(7%)、脂質(1%)、糖類(0.1%)、無機鹽類(0.9%)、代謝產物：尿素、肌酐、尿酸等。血漿蛋白有白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原三類。當與雞胚胎汁混合后發(fā)生凝固，構成細胞生長的環(huán)境，有利于細胞向三維空間生長。缺點；易于液化。雞胚浸出液：含有生長因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有刺激細胞生長作用，為早年培養(yǎng)使用的培養(yǎng)用液，現已被合成培養(yǎng)液所代替。2/2/2024水解乳蛋白：乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸。膠原：細胞生長的良好基質，利于細胞附著，改善細胞外表性質，利于細胞生長。血清：天然培養(yǎng)基中最重為重要和組織培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。含有多種不可缺少的能維持細胞生長增值的成分。2/2/2024血清主要成分分類多種蛋白質〔白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等〕多種金屬離子激素；促貼附物質，如纖粘蛋白、膠原等。各種生長因子未知成分2/2/2024

血清的主要成分及含量2/2/2024細胞培養(yǎng)中使用血清也有弊端對大多數細胞來說血清不是它們接觸的生理學液體。含有一些對細胞會產生毒性的物質，如多胺氧化酶、補體、抗體等。每批血清都有差異，其成分不能保持一致。取材過程有可能帶入支原體、病毒。2/2/2024血清的質量標準

理化性質：重要指標球蛋白和血紅蛋白含量。微生物檢測：細菌、真菌、病毒、支原體等促細胞生長效果：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

2/2/2024血清的使用與儲存

使用前處理：56℃30分鐘滅活補體。儲存條件：－20℃保存，防止反復凍融。使用濃度：一般為5－20％，最常用是10％。出現絮狀沉淀物的處理：直接使用或離心。2/2/2024合成培養(yǎng)基目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如DMEM、RPMI-1640、TC199、MEM等。成分：必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其它輔助物質。常需要添加的成分：NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定。本錢低缺點：不能完全滿足體外細胞生長需要。只能維持細胞生存，常需補充一定量的天然培養(yǎng)基〔如血清〕。2/2/2024

完全培養(yǎng)基的組成根底培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升2/2/2024〔3〕消化液胰蛋白酶胰蛋白酶是一種黃白色粉末，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％，pH8.0。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞別離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用2/2/2024

EDTA溶液：解離細胞，常用濃度0.02%，與胰酶混合使用膠原酶溶液：用于上皮細胞的原代培養(yǎng)，作用于膠原，對細胞影響很小。2/2/2024〔4〕pH調整液NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH到達設計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換到達平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求參加NaHCO3。此時常用5.6%or7.4%的NaHCO3溶液調節(jié)培養(yǎng)基，使之到達所要求的pH環(huán)境。2/2/2024HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌嗪乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，假設加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

2/2/2024培養(yǎng)基配制應注意的問題認真查看說明書〔成分、本卷須知〕器皿要滅菌加溫去離子水〔滅菌〕至15-30度參加培養(yǎng)基干粉，攪拌至溶解參加須補充的成分、NaHCO3、調節(jié)pH后定容用0.22m以下孔徑的微濾膜過濾分裝，4度儲存，用時參加血清〔終濃度10％〕2/2/2024二、實驗目的1.掌握DMEM培養(yǎng)基、胰酶的配制2.學習針頭濾器的使用方法2/2/2024三、實驗步驟(一〕DMEM培養(yǎng)基的配制1.水的準備2/2/20242.3袋DMEM粉末用雙蒸水溶解、磁力攪拌器攪拌半小時以上。2/2/2024參加3.6gNaHCO3，定容至3000mL、攪拌30分鐘。4.每人在超凈臺內用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字?！擦羧∩僭S做污染測試放CO2培養(yǎng)箱72小時〕每8個人為一組，每人過濾90mL。

2/2/2024下周使用前在超凈臺內參加FCS〔胎牛血清〕10mL，使血清的終濃度為10%，4℃保存待用。2/2/2024〔二〕胰酶的配制1.取無菌的D–Hanks液200mL〔8人一組〕2.稱取0.5g胰酶〔0.25%〕，在超凈臺中移至無菌的研磨器中，加少量〔0.5毫升〕D–Hanks液研磨,200次/人，使成為糊狀〔IceCream樣〕(夏天時研磨器應放在冰浴中),2/2/20243.參加D–Hanks液約150mL，加EDTA至0.02%(質量/體積,2%母液加2mL〕用NaHCO3調pH至8.0。邊調pH