臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)概論

概論第01講概論〔一〕學(xué)習(xí)免疫學(xué)的根本概念，了解臨床免疫學(xué)的理論根底，掌握免疫技術(shù)的檢測原理是學(xué)習(xí)和研究臨床免疫學(xué)與免疫技術(shù)的重要保障。

免疫學(xué)簡介

臨床免疫學(xué)

臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)免疫的概念

宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，能識別并去除從外環(huán)境中侵入的病原生物及其產(chǎn)生的毒素、內(nèi)環(huán)境中因基因突變產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞、自身衰老殘損的組織細(xì)胞或自身變性抗原，實(shí)現(xiàn)免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視的功能，保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)免疫器官免疫細(xì)胞免疫分子中樞外周膜型分子分泌型分子胸腺骨髓脾臟、淋巴結(jié)、黏膜伴隨淋巴組織淋巴細(xì)胞〔T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞〕

免疫輔助細(xì)胞〔吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等〕TCR

BCR

CD分子

粘附分子

MHC

其他免疫球蛋白

補(bǔ)體分子

細(xì)胞因子免疫系統(tǒng)-免疫器官與組織

中樞免疫器官免疫系統(tǒng)-免疫細(xì)胞

T細(xì)胞

B細(xì)胞

第02講概論〔二〕免疫系統(tǒng)－免疫分子

1.免疫球蛋白

2.補(bǔ)體系統(tǒng)

3.細(xì)胞因子

4.黏附分子

5.CD抗原

人類白細(xì)胞分化抗原〔HLA〕是指血細(xì)胞在分化成熟為不同譜系、分化的不同階段及細(xì)胞活化過程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞外表標(biāo)記分子。

采用單克隆抗體鑒定識別的自細(xì)胞分化抗原稱CD抗原。

檢測CD抗原是實(shí)驗(yàn)室識別細(xì)胞及不同分化階段細(xì)胞或細(xì)胞亞群最主要的方法。免疫功能生理性〔有利〕病理性〔不利〕免疫防御抗感染免疫缺陷病

超敏反響免疫自穩(wěn)去除損傷或衰老細(xì)胞自身免疫病免疫監(jiān)視殺傷和去除

異常突變細(xì)胞腫瘤

持續(xù)病毒感染免疫應(yīng)答

☆固有免疫，innateimmunity。

★適應(yīng)性免疫，adaptiveimmunity。

體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答。

臨床免疫學(xué)

臨床免疫學(xué)是將免疫學(xué)根底理論、臨床疾病與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，用于研究疾病的免疫病理機(jī)制、診斷與鑒別診斷、評價治療效果和判斷預(yù)后的多個分支學(xué)科的總稱。

免疫病理與免疫性疾病

移植免疫學(xué)

腫瘤免疫學(xué)

感染免疫學(xué)臨床免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)

臨免疫檢驗(yàn)可分為兩局部，一局部為利用免疫檢測原理與技術(shù)檢測免疫相關(guān)物質(zhì)；另一局部是利用免疫檢測原理與技術(shù)檢測體液中微量物質(zhì)?！玖?xí)題】

免疫的概念是指機(jī)體免疫系統(tǒng)具有

A.發(fā)現(xiàn)并排除有毒因子的能力

B.識別和排除抗原性異物的能力

C.抵抗并去除傳染性因子的能力

D.發(fā)現(xiàn)和消除惡變細(xì)胞的能力

E.去除體內(nèi)衰老損傷細(xì)胞的能力

『正確答案』B

『答案解析』免疫的概念是指機(jī)體免疫系統(tǒng)具有識別和排除抗原性異物的能力。機(jī)體免疫自穩(wěn)功能低下，可導(dǎo)致

A.免疫缺陷病

B.免疫增殖病

C.自身免疫病

D.惡性腫瘤

E.超敏反響

『正確答案』C

『答案解析』免疫自穩(wěn)是去除損傷或衰老細(xì)胞，功能低下時可導(dǎo)致自身免疫病。人體內(nèi)最大的外周免疫器官是

A.胸腺

B.骨髓

C.脾

D.淋巴結(jié)

E.法氏囊

『正確答案』C

『答案解析』人體內(nèi)最大的外周免疫器官是脾。可非特異直接殺傷靶細(xì)胞的是

A.NK細(xì)胞

B.Th細(xì)胞

C.Ts細(xì)胞

D.Tc細(xì)胞

E.TCRαβ＋細(xì)胞

『正確答案』A

『答案解析』NK細(xì)胞可非特異直接殺傷靶細(xì)胞。新生兒從初乳中獲得的Ig主要是

A.IgE

B.IgD

C.IgG

D.SIgA

E.IgM

『正確答案』D

『答案解析』新生兒從初乳中獲得的Ig主要是SIgA。特異性免疫效應(yīng)功能不包括

A.漿細(xì)胞分泌特異性抗體，執(zhí)行體液免疫功能

B.Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等效應(yīng)因子，執(zhí)行細(xì)胞免疫功能

C.CTL細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞

D.產(chǎn)生記憶細(xì)胞

E.中性粒細(xì)胞吞噬與殺滅細(xì)菌

『正確答案』E

『答案解析』中性粒細(xì)胞吞噬與殺滅細(xì)菌屬于固有免疫，是非特異性免疫。粘膜伴隨的淋巴組織主要的功能是

A.B、T淋巴細(xì)胞棲息和增殖場所

B.各種免疫細(xì)胞的發(fā)源地

C.T細(xì)胞分化成熟的場所

D.B細(xì)胞分化成熟的場所

E.主要產(chǎn)生IgA及分泌性IgA，執(zhí)行體液免疫與局部特異免疫作用

『正確答案』E

『答案解析』粘膜伴隨的淋巴組織主要的功能是分泌性IgA?？乖贵w反響第01講抗原抗體反響抗原抗體反響

抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反響。

體內(nèi)反響可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等體液免疫效應(yīng)；

體外反響那么根據(jù)抗原、抗體性質(zhì)的不同和反響條件的差異，在抗原抗體復(fù)合物形成后表現(xiàn)為不同的現(xiàn)象。包括：沉淀反響、凝集反響等。

★抗原抗體反響〔antigen-antibodyreaction〕

抗原抗體反響的原理

抗原抗體反響的特點(diǎn)

影響抗原抗體反響的因素

免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型

抗原抗體反響的原理

一、抗原抗體結(jié)合力

抗原和抗體的結(jié)合為分子間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的特異結(jié)合，是一種非共價的結(jié)合，不形成牢固的共價鍵。在抗原抗體特異結(jié)合后有四種分子間引力參與并促進(jìn)其結(jié)合。

靜電引力

范德華引力

氫鍵

疏水作用力靜電引力

〔electrostaticforces〕

范德華引力：作用最小。

〔vanderWaalsinteractions〕

氫鍵：最具特異性。

〔hydrogenbond〕

疏水作用力：作用最大。〔hydrophobicinteractions〕

二、抗原抗體的親和力與親合力

親和性〔affinity〕

抗體分子上一個抗原結(jié)合點(diǎn)與一個相應(yīng)抗原表位之間結(jié)合強(qiáng)度，抗原抗體的親和性取決于兩者空間構(gòu)型互補(bǔ)的程度。

親合力〔avidity〕

指一個完整抗體分子的抗原結(jié)合部位與假設(shè)干相應(yīng)抗原表位之間的結(jié)合強(qiáng)度。與親和性、抗體結(jié)合價、抗原的有效抗原表位有關(guān)。

Avidity

TheoverallstrengthofbindingbetweenanAgwithmanydeterminantsandmultivalentAbs

三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體

抗原抗體反響的特點(diǎn)

特異性

可逆性

比例性

階段性一、特異性

抗原與抗體結(jié)合反響的專一性

分子根底：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性。

兩種不同的抗原分子具有局部相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反響，稱為交叉反響。二、比例性

抗原與抗體發(fā)生可見反響需遵循一定的量比關(guān)系

等價帶：抗原抗體比例適宜。

帶現(xiàn)象：抗原抗體比例不適宜。

前帶：抗體過量。

后帶：抗原過量。

三、可逆性

免疫復(fù)合物可在一定條件下解離為游離抗原與抗體

影響因素：

抗體對相應(yīng)抗原的親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離。

環(huán)境因素對復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度。

四、階段性

影響抗原抗體反響的因素

一、反響物自身因素

1.抗原

抗原的理化性狀、外表抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反響的結(jié)果。

2.抗體

抗體的來源、濃度、特異性與親和性均可影響抗原抗體反響。二、環(huán)境因素

電解質(zhì)：生理鹽水或緩沖液。

酸堿度：pH6～9。

溫度：15℃～40℃，37℃最適。免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的類型

取決于：

抗原、抗體的性質(zhì)

反響條件

其他參與成分

五種主要類型：

凝集反響

沉淀反響

補(bǔ)體參與的反響

中和反響

標(biāo)記免疫反響【習(xí)題】

抗原抗體結(jié)合力中作用最大的是

A.靜電引力

B.范德華引力

C.氫鍵結(jié)合力

D.疏水作用力

E.分子間結(jié)合力

『正確答案』D

『答案解析』抗原抗體結(jié)合力中作用最大的是疏水作用力。用抗原或抗體來檢測相對應(yīng)的抗體或抗原，是由于抗原抗體反響具有

A.特異性

B.比例性

C.可逆性

D.親和性

E.帶現(xiàn)象

『正確答案』A

『答案解析』抗原或抗體來檢測相對應(yīng)的抗體或抗原是由于抗原抗體反響具有特異性?？乖贵w反響比例不適宜出現(xiàn)的沉淀物減少的現(xiàn)象稱為

A.前帶

B.后帶

C.帶現(xiàn)象

D.等價帶

E.等電點(diǎn)

『正確答案』C

『答案解析』抗原抗體反響比例不適宜出現(xiàn)的沉淀物減少的現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象。有關(guān)交叉反響的描述，正確的選項(xiàng)是

A.為非特異性抗原抗體反響

B.由于不同抗原分子上存在共同抗原表位所致

C.對免疫學(xué)診斷結(jié)果判斷沒影響

D.利用交叉反響進(jìn)行診斷典型例子是肥達(dá)試驗(yàn)

E.利用交叉反響進(jìn)行診斷典型例子是庫姆試驗(yàn)

『正確答案』B

『答案解析』交叉反響是由于不同抗原分子上存在共同抗原表位。以下關(guān)于抗原抗體反響的特點(diǎn)表述，正確的選項(xiàng)是

A.抗原抗體反響有交叉反響，故抗原抗體反響特異性不強(qiáng)

B.抗原抗體反響必須抗體量略大于抗原量

C.抗原抗體反響形成的復(fù)合物又可解離為游離的抗原與抗體

D.抗體與抗原結(jié)合牢固，不易被解離

E.抗原抗體反響分為兩個階段，兩個階段之間有明顯的界限

『正確答案』C

『答案解析』抗原抗體反響形成的復(fù)合物又可解離為游離的抗原與抗體，這是抗原抗體反響的可逆性。免疫原和抗血清的制備第01講免疫原和抗血清的制備免疫原和抗血清的制備

抗原和抗體是免疫反響的根本條件也是免疫檢驗(yàn)的兩大重要因素?？乖侵苽涮禺愋钥贵w的前提條件，抗體可用于純化抗原和檢測抗原，也是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中用于疾病診斷和研究的重要物質(zhì)。

免疫原的制備

免疫佐劑

抗血清的制備

抗血清的鑒定和保存

抗血清的純化顆粒性抗原的制備

顆粒性抗原主要是指細(xì)胞抗原和細(xì)菌抗原,制備的方法較簡單,通過別離或純培養(yǎng)即可得到。

細(xì)胞抗原——綿羊紅細(xì)胞。

細(xì)菌抗原——菌體O抗原。

可溶性抗原的制備

可溶性抗原：蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素等。

〔一〕組織可溶性抗原的粗提

〔二〕可溶性抗原的純化

〔三〕純化抗原的鑒定〔一〕組織可溶性抗原的粗提

1.組織均漿的制備：高速組織搗碎機(jī)法、研磨法；

2.細(xì)胞的破碎：反復(fù)凍融法、超聲破碎法、自溶法、酶處理法、外表活性劑處理法。

〔二〕可溶性抗原的提取和純化

1.超速離心法；

2.選擇性沉淀法：核酸去除法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、聚合物沉淀法；

3.凝膠過濾法；

4.離子交換層析法；

5.親和層析法；

6.電泳法。

〔三〕純化抗原的鑒定

主要包括蛋白含量測定、分子量測定、純度鑒定、免疫活性鑒定等。半抗原性免疫原的制備

半抗原只具有抗原性而無免疫原性；如某些多肽、多糖、激素、小分子量的藥物等。半抗原與蛋白質(zhì)載體或高分子聚合物結(jié)合后才有免疫原性。

〔一〕載體

1.蛋白質(zhì)類：牛血白蛋白等；

2.多肽聚合物：多聚賴氨酸等；

3.大分子聚合物和某些顆粒：聚乙烯吡咯烷酮等。

〔二〕半抗原與載體的連接方法

1.物理方法：通過電荷和微孔吸附半抗原，吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等。

2.化學(xué)方法：利用某些功能基團(tuán)將半抗原連接到載體上。如碳二亞胺法、戊二醛法等。

〔三〕半抗原性免疫原的鑒定

與載體結(jié)合的半抗原數(shù)目與免疫原性密切相關(guān)。所以，應(yīng)測定半抗原與載體的比例，方法有：①吸收光譜分析法：②放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法。免疫佐劑

指先于抗原或與抗原同時注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。

佐劑的作用機(jī)制

①改變抗原的物理性狀，延緩抗原降解和排除；

②增強(qiáng)APC處理和提呈抗原的能力；

③刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化；

④改變抗體的產(chǎn)生類型；

⑤誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反響?？寡宓闹苽?/p>

將制備好的免疫原按照一定的程序，免疫動物，使其產(chǎn)生多克隆抗體。然后采集動物血液，別離含有抗體的血清，即為抗血清。

免疫動物的選擇

1.抗原來源與動物種屬差異越大，免疫原性越強(qiáng)，免疫效果越好。

2.適齡、健康、體重適宜。

3.對于蛋白質(zhì)抗原大局部動物皆適合，常用的是山羊和家兔。免疫程序

1.免疫原的劑量：由免疫原性的強(qiáng)弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間確定。

2.免疫途徑：初次免疫一般選擇皮內(nèi)接種，加強(qiáng)免疫和顆粒性抗原一般選擇靜脈注射。

3.免疫間隔時間：重要因素。第1次與第2次免疫間隔時間以10～20天為好，第3次及以后的間隔一般為7～10天。動物采血法

1.頸動脈采血法

2.心臟采血法

3.靜脈采血法抗血清的鑒定和保存

抗血清的鑒定

1.抗體特異性的鑒定

2.抗體效價的測定

3.抗體純度的鑒定

4.抗體親和力的鑒定抗血清的保存

①2～8℃保存：用于短期保存；

②冷凍保存：一般可保存5年；

③真空枯燥保存：用真空凍干機(jī)進(jìn)行枯燥，在冰箱中可保存5～10年?？寡宓募兓?/p>

純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等。【習(xí)題】屬于顆粒性抗原的是

A.脂多糖

B.球蛋白

C.白蛋白

D.DNA

E.血小板

『正確答案』E

『答案解析』顆粒性抗原包括血小板?？扇苄钥乖旱鞍踪|(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素等。顆粒性抗原免疫接種方法一般采用

A.淋巴結(jié)注射

B.靜脈注射

C.皮內(nèi)注射

D.皮下注射

E.肌肉內(nèi)注射

『正確答案』B

『答案解析』顆粒性抗原免疫接種方法一般采用靜脈注射。要從組織和細(xì)胞勻漿中粗提某種蛋白抗原，最常用又簡便的別離方法

A.鹽析法

B.凝膠過濾法

C.離子交換層析法

D.免疫親和層析法

E.免疫電泳法

『正確答案』A

『答案解析』鹽析法是組織和細(xì)胞中粗提蛋白抗原最常用且簡便的別離方法。純化特異性抗體時，可采用以下哪種方法除去雜抗體

A.鹽析法

B.凝膠過濾法

C.離子交換層析法

D.免疫親和層析法

E.免疫電泳法

『正確答案』D

『答案解析』免疫親和層析法能有效的去除雜抗體。蛋白質(zhì)抗原首次免疫接種后，最好間隔多長時間再進(jìn)行第二次免疫

A.7～10天

B.10～20天

C.20～30天

D.30～60天

E.3個月

『正確答案』B

『答案解析』蛋白質(zhì)抗原首次免疫接種后，最好間隔10～20天再進(jìn)行第二次免疫。免疫小鼠的采血方法常為

A.靜脈采血法

B.心臟采血法

C.頸動脈放血法

D.斷尾法或摘除眼球法

E.股動脈放血法

『正確答案』D

『答案解析』免疫小鼠的采血方法常為斷尾法或摘除眼球法。單克隆抗體與基因工程抗體的制備第01講單克隆抗體與基因工程抗體的制備單克隆抗體與基因工程抗體的制備

由一個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，針對單一表位、結(jié)構(gòu)相同、功能均一的抗體，稱為單克隆抗體〔mAb〕。

第一代抗體：多克隆抗體〔pAb〕；

第二代抗體：單克隆抗體〔mAb〕；

第三代抗體：基因工程抗體〔GEAb〕。

雜交瘤技術(shù)的根本原理

單克隆抗體的制備

基因工程抗體制備

單克隆抗體的應(yīng)用

GeorgesKohlerandCesarMilstein,1975,discoveredhybridomatechnique

1984雜交瘤技術(shù)

1.小鼠骨髓瘤細(xì)胞

①細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；

②細(xì)胞株自身不會產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子；

③次黃嘌呤磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶〔HGPRT〕的缺陷株。2.免疫脾細(xì)胞

①與骨髓瘤細(xì)胞同源的純系小鼠；

②皮內(nèi)多點(diǎn)注射抗原。

3.細(xì)胞融合

PEG可能導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜容易翻開而有助于細(xì)胞融合。

4.雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存

有限稀釋法

有限稀釋法單克隆抗體的制備

單克隆抗體的產(chǎn)生

體內(nèi)誘生法

體外培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液顏色改變或細(xì)胞過多開始死亡時，收集上清液，離心去掉碎片及細(xì)胞即可。單克隆抗體的純化

①用半飽和、飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，到達(dá)初步濃縮和純化的目的。

②經(jīng)過適當(dāng)溶解和充分稀釋后，用親和層析法進(jìn)一步純化。

單克隆抗體的性質(zhì)鑒定

Ig類型測定、特異性測定、抗體效價測定、表位測定、親和力測定。

單克隆抗體的特性

1.高度特異性。

2.高度的均一性和可重復(fù)性。

3.弱凝集反響和不呈現(xiàn)沉淀反響。

4.對環(huán)境敏感性。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)

〔1〕雜交瘤可以在體外“永久〞地存活并傳代。

〔2〕可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。

〔3〕適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。

〔4〕由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。

單克隆抗體的局限性

〔1〕單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。

〔2〕反響強(qiáng)度不如多克隆抗體。

〔3〕制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時費(fèi)工，價格較高?；蚬こ炭贵w制備

多克隆抗體和單克隆抗體來自異種動物，用于人體會引起很強(qiáng)的排斥反響。應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對抗體編碼基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體，稱為基因工程抗體。

①降低甚至消除人體對抗體的排斥反響；

②分子量較小，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；

③根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；

④生產(chǎn)本錢低。

人源化抗體、小分子抗體、抗體融合蛋白、雙特異性抗體、噬菌體抗體庫技術(shù)。單克隆抗體的應(yīng)用

檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑

單克隆抗體廣泛應(yīng)用于ELISA、放射免疫分析、免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)，并且單克隆抗體的應(yīng)用很大程度上促進(jìn)了商品化試劑盒的開展。

①病原微生物抗原、抗體的檢測；②腫瘤抗原的檢測；③免疫細(xì)胞及其亞群的檢測；④激素測定；⑤細(xì)胞因子的測定蛋白質(zhì)的提純

【習(xí)題】單克隆抗體目前效果較好的純化方法

A.親和層析法

B.凝膠過濾法

C.離子交換層析法

D.超速離心法

E.鹽析法

『正確答案』A

『答案解析』單克隆抗體目前效果較好的純化方法是親和層析法。在HAT選擇培養(yǎng)基中可長期存活者是

A.細(xì)胞多聚體

B.融合的脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞

C.融合的瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞

D.未融合的瘤細(xì)胞

E.未融合的脾細(xì)胞

『正確答案』B

『答案解析』融合的脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞能在HAT選擇培養(yǎng)基中可長期存活。雜交瘤技術(shù)中的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備的特點(diǎn)不包括

A.穩(wěn)定和易培養(yǎng)

B.自身無分泌功能

C.細(xì)胞無惡性變化

D.融合度高

E.HGPRT缺陷

『正確答案』C

『答案解析』雜交瘤技術(shù)中的骨髓瘤細(xì)胞需要其惡性變化。小鼠骨髓瘤細(xì)胞與以下哪種細(xì)胞融合

A.經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞

B.經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞

C.未經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞

D.未經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞

E.淋巴細(xì)胞

『正確答案』A

『答案解析』小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞融合。關(guān)于雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)的錯誤描述

A.具備了雙親細(xì)胞的特點(diǎn)

B.分泌人源性單克隆抗體

C.分泌鼠源性單克隆抗體

D.體外繁殖快速

E.能分泌抗體

『正確答案』B

『答案解析』雜交瘤細(xì)胞是分泌鼠源性單克隆抗體，而不是人源性單克隆抗體。HAT培養(yǎng)基中三種關(guān)鍵成分為

A.次黃嘌嶺、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

B.黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

C.氨基嘌嶺、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

D.腺嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

E.鳥嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷

『正確答案』A

『答案解析』HAT培養(yǎng)基中三種關(guān)鍵成分為次黃嘌嶺、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷。凝集反響第01講凝集反響凝集反響

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反響。

凝集反響的特點(diǎn)

直接凝集反響

間接凝集反響

凝集反響的特點(diǎn)

1.可定性檢測，也可進(jìn)行半定量檢測。

2.靈敏度高、方法簡便，因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。

3.分為兩個階段：①抗原抗體的特異性結(jié)合；②出現(xiàn)可見的顆粒凝聚。直接凝集反響

細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。

玻片凝集試驗(yàn)

試管凝集試驗(yàn)

間接凝集反響

將可溶性抗原〔或抗體〕先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體外表〔致敏顆?！?，然后與相應(yīng)抗體〔或抗原〕作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反響。間接凝集反響的類型

1.正向間接凝集反響

可溶性抗原致敏載體，用于檢測標(biāo)本中相應(yīng)抗體的方法。簡便、快速、敏感性和特異性好，本錢低。2.反向間接凝集反響

選用特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原。3.間接凝集抑制反響

先將可溶性抗原〔或抗體〕與相應(yīng)的抗體〔或抗原〕混合，然后再參加抗原〔或抗體〕致敏的紅細(xì)胞，那么能抑制原先的血凝現(xiàn)象。

4.協(xié)同凝集反響

實(shí)質(zhì)上是反向間接凝集試驗(yàn)，但所用載體是金黃色葡萄球菌。方法簡便、快速、靈敏，可用于細(xì)菌、病毒、毒素及各種可溶性抗原的檢測。間接血凝試驗(yàn)

是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，具有簡便、快速、本錢低廉等特點(diǎn)，其敏感性高于膠乳凝集試驗(yàn)和直接凝集反響。

膠乳凝集試驗(yàn)

是以聚苯乙烯膠乳微?！?.8μm〕作為載體，將抗原〔或抗體〕與膠乳顆粒結(jié)合成為致敏乳膠后，直接用以檢測標(biāo)本中相應(yīng)抗體〔或抗原〕的凝集反響。

明膠凝集試驗(yàn)

將病毒抗原或重組抗原吸附于粉紅色明膠顆粒上，當(dāng)致敏顆粒與樣品血清作用時，假設(shè)血清含有抗病毒抗體那么可形成肉眼可見的粉紅色凝集。

間接凝集反響的應(yīng)用

快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，可用于抗原或抗體的測定?！玖?xí)題】試管凝集試驗(yàn)的效價判斷標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)出現(xiàn)肉眼可見的如下凝集現(xiàn)象

A.+

B.+或++

C.++

D.+++

E.++++

『正確答案』C

『答案解析』試管凝集試驗(yàn)的效價判斷標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)出現(xiàn)肉眼可見的++凝集現(xiàn)象。間接凝集反響不能檢測

A.抗體

B.AFP抗原

C.傷寒沙門菌菌體抗原

D.類風(fēng)濕因子

E.HCG抗原

『正確答案』C

『答案解析』傷寒沙門菌菌體抗原是顆粒性抗原，屬于直接凝集反響。關(guān)于正向間接凝集試驗(yàn)說法錯誤的選項(xiàng)是

A.抗原致敏載體

B.用于檢測標(biāo)本中抗原

C.出現(xiàn)凝集那么為陽性

D.敏感性高

E.特異性強(qiáng)

『正確答案』B

『答案解析』正向間接凝集試驗(yàn)用于檢測標(biāo)本中抗體。關(guān)于間接血凝試驗(yàn)說法錯誤的選項(xiàng)是

A.紅細(xì)胞作為載體

B.不能檢測抗原

C.可檢測抗體

D.可判斷陽性反響的強(qiáng)弱

E.應(yīng)用廣泛

『正確答案』B

『答案解析』間接血凝試驗(yàn)可以檢測抗原也可以檢測抗體。關(guān)于反向間接凝集試驗(yàn)說法錯誤的選項(xiàng)是

A.抗體致敏載體

B.用于檢測標(biāo)本中抗原

C.出現(xiàn)凝集為陰性

D.敏感性高

E.特異性強(qiáng)

『正確答案』C

『答案解析』反向間接凝集試驗(yàn)出現(xiàn)凝集為陽性。關(guān)于間接凝集抑制試驗(yàn)說法錯誤的選項(xiàng)是

A.檢測標(biāo)本中抗原

B.出現(xiàn)凝集為陽性

C.抗體為診斷試劑

D.抗原致敏載體

E.不出現(xiàn)凝集為陽性

『正確答案』B

『答案解析』間接凝集抑制試驗(yàn)出現(xiàn)凝集為陰性。協(xié)同凝集試驗(yàn)所用的載體是

A.新鮮紅細(xì)胞

B.洗滌紅細(xì)胞

C.醛化紅細(xì)胞

D.聚苯乙烯顆粒

E.金黃色葡萄球菌

『正確答案』E

『答案解析』協(xié)同凝集試驗(yàn)所用的載體是金黃色葡萄球菌。沉淀反響第01講沉淀反響沉淀反響

蛋白質(zhì)、多糖、毒素等可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下特異性結(jié)合，出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象，稱為沉淀反響。

沉淀反響的特點(diǎn)

液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)

凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)

免疫電泳技術(shù)沉淀反響的特點(diǎn)差異凝集反響沉淀反響抗原性質(zhì)顆粒性抗原可溶性抗原反響時間數(shù)分鐘數(shù)小時反響產(chǎn)物凝集物沉淀物敏感性高低液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)

受抗原抗體比例的影響非常明顯，常用作測定抗原抗體的最適比例。有抗原稀釋法、抗體稀釋法和棋盤滴定法。免疫濁度測定

應(yīng)用抗原、抗體在液相中反響后形成的免疫復(fù)合物微粒對光線的干擾，利用儀器進(jìn)行定量檢測的一種方法。

在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物的量呈正相關(guān)。

免疫濁度測定的影響因素

1.抗原抗體比例

當(dāng)反響液中抗體過量時，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達(dá)最頂峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。2.抗體的質(zhì)量

要求：抗體的特異性強(qiáng)、效價高、親和力強(qiáng)。

R型＞H型。

3.抗原抗體反響的溶液

pH6.5～8.5，磷酸鹽緩沖液。

4.增濁劑

聚乙二醇〔PEG〕、吐溫-20，可消除抗原或抗體分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。免疫比濁方法分類

透射和散射免疫比濁法

免疫膠乳比濁法

凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)

單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

Mancini曲線：適用大分子抗原和長時間擴(kuò)散〔＞48小時〕的結(jié)果；

公式：c／d2＝k。

Fahey曲線：適用于小分子抗原和較短時間〔＜24h〕擴(kuò)散的結(jié)果處理，用半對數(shù)紙畫線。

公式：logc／d＝k。雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反響的結(jié)合產(chǎn)物。

1.加快了反響速度

2.集中了擴(kuò)散方向

3.分開了不同的蛋白

火箭免疫電泳

免疫電泳

免疫固定電泳

免疫固定電流模式圖沉淀反響在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用方法評價應(yīng)用經(jīng)典沉淀反響試驗(yàn)操作繁瑣、敏感度低、精密度差、時間長和難以自動化逐漸減少免疫比濁法穩(wěn)定性好，敏感度高〔達(dá)ng／L〕，精確度，簡便快速，易于自動化，無放射性核素污染，適合于大批量標(biāo)本的檢測血液、體液中蛋白質(zhì)的測定免疫固定電泳技術(shù)分辨力強(qiáng)，敏感度高，結(jié)果易于分析M蛋白的鑒定與分型【習(xí)題】以下哪項(xiàng)不是沉淀反響的特點(diǎn)

A.其特性與經(jīng)典抗原抗體反響相同

B.抗原是可溶性抗原

C.反響可分為兩個階段

D.抗體是McAb

E.需一定電解質(zhì)

『正確答案』D

『答案解析』沉淀反響抗體不是單克隆抗體。Mancini曲線

A.適用于小分子抗原，擴(kuò)散時間大于48h

B.適用于小分子抗原，擴(kuò)散時間小于24h

C.適用于大分子抗原，擴(kuò)散時間小于24h

D.抗原濃度與沉淀環(huán)直徑的平方呈線性關(guān)系

E.使用半對數(shù)坐標(biāo)紙作圖

『正確答案』D

『答案解析』Mancini曲線抗原濃度與沉淀環(huán)直徑的平方呈線性關(guān)系。單向瓊脂擴(kuò)散法可用于

A.抗體定性

B.抗體定量

C.抗原定性

D.抗原定量

E.抗體效價滴定

『正確答案』D

『答案解析』單向瓊脂擴(kuò)散法可用于抗原定量。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)多條沉淀線的原因

A.抗原抗體過剩

B.抗原抗體相等

C.抗原抗體缺乏

D.抗原抗體不純

E.抗原抗體分子量不等

『正確答案』D

『答案解析』雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)多條沉淀線是由于抗原抗體不純。根據(jù)海德堡曲線，以下說法錯誤的選項(xiàng)是

A.抗原過量時產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)，沉淀物少

B.抗體過量時，沉淀物也少

C.抗原抗體比例適當(dāng)時產(chǎn)生沉淀量最多

D.免疫比濁法中抗原過量導(dǎo)致測量失敗

E.免疫比濁法中抗體過量導(dǎo)致測量失敗

『正確答案』E

『答案解析』海德堡曲線免疫比濁法中抗原過量導(dǎo)致測量失敗。放射免疫分析第01講放射免疫分析放射免疫分析

放射免疫分析是利用放射性核素可探測的靈敏性、精確性和抗原抗體反響特異性相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。

放射免疫技術(shù)

放射免疫分析

免疫放射分析

放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用

放射免疫技術(shù)

具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對相關(guān)學(xué)科的開展起到了極大的推動作用。根本類型及原理

1.放射免疫分析〔RIA〕

2.免疫放射分析〔IRMA〕

常用的放射性核素

放射免疫技術(shù)常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。使用最廣泛的是125Ⅰ，可采用探測γ射線的晶體閃爍計(jì)數(shù)器測量。標(biāo)志物制備及鑒定

125Ⅰ以放射性碘原子通過置換被標(biāo)志物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。

〔1〕氯胺T〔ch-T〕法。

〔2〕乳過氧化物酶標(biāo)記法。

〔3〕間接標(biāo)記法。

放射性標(biāo)志物的純化

〔1〕凝膠過濾法：分子篩。

〔2〕離子交換層析法：極性差異。

〔3〕聚丙烯酰胺凝膠電泳法〔PAGE〕：電荷和直徑。

〔4〕高效液相色譜法。放射性標(biāo)志物的鑒定

1.放射化學(xué)純度：大于95%。

2.免疫活性：標(biāo)志物與抗體結(jié)合的能力。

3.比放射性：標(biāo)志物中所含的放射性強(qiáng)度。

方法學(xué)評價

除常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性等指標(biāo)外，還應(yīng)注意以下指標(biāo)：

〔1〕可靠性。

〔2〕劑量-反響曲線。

〔3〕高劑量鉤狀效應(yīng)。放射免疫分析

放射免疫分析〔radioimmunoassay，RIA〕是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反響系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合有限的特異性抗體為根本原理來測定待檢樣品中抗原量的一種分析法。

Ag*+Ag+AbAg*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag

別離結(jié)合與游離標(biāo)志物

1.第二抗體沉淀法。

2.聚乙二醇〔PEG〕沉淀法。

3.PR試劑法：先將二抗與PEG按一定比例混合成懸液后進(jìn)行試驗(yàn)。

4.活性炭吸附法。放射性測量及數(shù)據(jù)處理

可對標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物〔B〕或游離標(biāo)記抗原〔F〕進(jìn)行放射性測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出相應(yīng)的待檢抗原濃度。

免疫放射分析

免疫放射分析〔immunoradiometricassay，IRMA〕是以過量125Ⅰ標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反響，用固相免疫吸附劑對B或F進(jìn)行別離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA，操作程序較RIA簡單。

Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*單位點(diǎn)IRMA

過量標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行反響，平衡后，再用固相抗原結(jié)合反響液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其別離，測定上清液的放射量。

雙位點(diǎn)IRMA

形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄反響液中剩余的標(biāo)記抗體，測定固相上的放射性。

RIA與IRMA的比擬RIAIRMA標(biāo)記物質(zhì)核素標(biāo)記Ag核素標(biāo)記Ab反響速率較慢較快反響原理競爭抑制非競爭性結(jié)合特異性特異性較低特異性較強(qiáng)分析誤差較大較小標(biāo)記物量限量過量應(yīng)用可測大分子量、小分子量的物質(zhì)測定2個以上抗原表位的物質(zhì)放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用

常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。

由于放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長，無法自動化分析等諸多缺乏。【習(xí)題】以下何種物質(zhì)不常用放射免疫技術(shù)分析

A.激素

B.微量蛋白質(zhì)

C.腫瘤標(biāo)志物

D.藥物

E.抗核抗體

『正確答案』E

『答案解析』放射免疫技術(shù)分析常用于檢測抗原類的物質(zhì)。125I標(biāo)記物的放射化學(xué)純度要求

A.＞80%

B.＞90%

C.＞95%

D.＞98%

E.＞99%

『正確答案』C

『答案解析』125I標(biāo)記物的放射化學(xué)純度要求＞95%。關(guān)于RIA，以下說法正確的選項(xiàng)是

A.標(biāo)記抗原限量

B.標(biāo)記抗體限量

C.抗體限量

D.標(biāo)準(zhǔn)抗原限量

E.待測抗原限量

『正確答案』C

『答案解析』RIA是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反響系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合有限的特異性抗體為根本原理來測定待檢樣品中抗原量的一種分析法關(guān)于IRMA說法正確的選項(xiàng)是

A.反響中參加過量的標(biāo)記抗原

B.反響中參加定量的標(biāo)記抗原

C.反響中參加過量抗體

D.反響中參加過量的標(biāo)記抗體

E.反響中參加定量的標(biāo)記抗體

『正確答案』D

『答案解析』IRMA是以過量125Ⅰ標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反響，用固相免疫吸附劑對B或F進(jìn)行別離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA，操作程序較RIA簡單。關(guān)于單位點(diǎn)IRMA說法正確的選項(xiàng)是

A.首先參加固相抗原與待測標(biāo)本

B.然后參加標(biāo)記抗體

C.測定固相免疫復(fù)合物的放射量

D.測定上清液的放射量

E.待測抗原需含二個以上表位

『正確答案』D

『答案解析』單位點(diǎn)IRMA，過量標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行反響，平衡后，再用固相抗原結(jié)合反響液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其別離，測定上清液的放射量。關(guān)于IRMA與RIA，說法錯誤的選項(xiàng)是

A.IRMA較RIA特異性高

B.IRMA較RIA靈敏度高

C.IRMA較RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬

D.IRMA所用抗體較少

E.RIA所用抗體較少

『正確答案』D

『答案解析』RIA所用抗體較少。熒光免疫技術(shù)第01講熒光免疫技術(shù)將抗原抗體反響與熒光技術(shù)相結(jié)合而建立的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。

概述

熒光抗體技術(shù)

熒光免疫分析的類型

熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。熒光

熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。

熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素

〔FITC〕四乙基羅丹明

〔RB200〕四甲基異硫氰酸羅丹明

〔TRITC〕藻紅蛋白

〔PE〕性狀黃色粉末橘紅色粉末紫紅色粉末褐紅色粉末溶解性易溶于水或乙醇等溶劑不溶于水，易溶于乙醇和丙酮不溶于水，易溶于乙醇和丙酮不溶于水，易溶于乙醇和丙酮最大吸收光波長490～495nm570nm550nm565nm最大發(fā)射光波長520～530nm595～600nm620nm578nm熒光顏色黃綠色橘紅色橙紅色橙色熒光應(yīng)用最廣泛常用有毒性常用其他熒光物質(zhì)

銪〔Eu3＋〕為三價稀土鑭系元素，其螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于時間分辨熒光免疫測定。

熒光抗體技術(shù)

熒光抗體技術(shù)是以熒光素標(biāo)記抗體，與切片中組織或細(xì)胞抗原反響，經(jīng)洗滌別離后，在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位。熒光抗體技術(shù)包括熒光抗體制備、標(biāo)本制作、熒光抗體染色和熒光顯微鏡檢查等內(nèi)容。熒光抗體的制備

1.抗體要求：用于標(biāo)記的抗體應(yīng)該具有高特異性和高親和力。

2.熒光素要求：①與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合者易于去除；②熒光效率高；③熒光色澤與背景組織比照鮮明；④不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)；⑤標(biāo)記方法簡單、平安無毒；⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

3.抗體的熒光素標(biāo)記：攪拌法和透析法。

4.熒光素標(biāo)記抗體的純化：去除未結(jié)合的游離的熒光素。可采用透析法或?qū)游鰟e離法。

5.熒光抗體的鑒定：熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率〔組織切片的熒光抗體染色以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色以F/P＝2.4為宜〕、抗體效價、抗體特異性。

6.熒光抗體的保存：小量分裝，-20℃凍存可保存1～2年。真空枯燥后可長期保存。稀釋后的抗體不宜長時間保存，在4℃可保存1～3天。標(biāo)本的制作

臨床標(biāo)本主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類。制作標(biāo)本要力求保持抗原的完整性、切片要求盡量薄、干擾物質(zhì)要充分洗去、平安。

熒光抗體染色與結(jié)果判斷

1.直接法

用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上，使之與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點(diǎn)是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。

2.間接法

可用于檢測抗原和抗體。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對抗原的特異抗體，第二抗體〔熒光抗體〕為針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。3.雙標(biāo)記法

本法用FITC及羅丹明分別標(biāo)記不同的抗體，而對同一標(biāo)本作熒光染色。在有兩種相應(yīng)抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。

4.熒光抗體染色結(jié)果判斷

每次實(shí)驗(yàn)時均需設(shè)立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)對照〔陽性和陰性對照〕。陽性細(xì)胞的顯色分布有胞質(zhì)型、胞核型和膜外表型三種類型，顯色深淺可作為抗原定性、定位和定量的依據(jù)。熒光顯微鏡

熒光顯微鏡能發(fā)射出一定波長的激發(fā)光對待測樣本進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的發(fā)射熒光，從而對組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡主要結(jié)構(gòu)根本相同，不同之處在于光源、濾光片、聚光器和消色差鏡頭等。

熒光免疫分析的類型

常用的熒光免疫分析測定方法主要有流式細(xì)胞分析技術(shù)、時間分辨熒光免疫測定、熒光偏振免疫測定和熒光酶免疫測定等。

時間分辨熒光免疫測定〔TRFIA〕

用鑭系元素〔Eu3+〕標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。1.時間分辨：非特異性熒光壽命較短〔1～10ns〕，最長不超過20ns。而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長〔10～1000μs〕。

2.Stokes位移：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長之差很大〔273nm〕，故極易將激發(fā)光和發(fā)射光分開。

3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：鑭系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm±10nm。利用615nm±5nm的濾光片只允許此波段的熒光通過，以供測量，排除了其余波長的熒光，且能量損失也不大。

4.信號增強(qiáng)：免疫反響完成后，參加酸性增強(qiáng)液，Eu3＋從復(fù)合物上完全解離下來，被另一種螯合劑所螯合，形成一個新的具有高強(qiáng)度熒光的穩(wěn)定螯合物，信號的增強(qiáng)效果可達(dá)上百萬倍。標(biāo)記物和標(biāo)記方法

Eu3＋最為常用。Eu3＋不能直接與抗原或抗體結(jié)合，需應(yīng)用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，其一端與鑭系元素離子結(jié)合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合，形成鑭系元素離子一螯合劑一抗原〔或抗體〕復(fù)合物。

方法類型

1.雙抗體夾心法

雙抗體夾心法待檢抗原與固相抗體結(jié)合，再與Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，在酸性增強(qiáng)液作用下，復(fù)合物上的Eu3+從免疫復(fù)合物中解離，形成新的微粒，在340nm激發(fā)光照射下，游離出的Eu3+螯合物可發(fā)射613nm的熒光。經(jīng)時間分辨熒光分析儀記錄計(jì)算出待檢抗原的含量。方法類型

2.固相抗體競爭法

待檢抗原和Eu3＋標(biāo)記的抗原與固相抗體發(fā)生競爭結(jié)合。

方法類型

3.固相抗原競爭法

待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的Eu3＋標(biāo)記抗體。

方法評價

時間分辨熒光免疫測定靈敏度高；分析范圍寬；標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，有效使用期長；測量快速，易自動化；無放射性污染。熒光偏振免疫測定

當(dāng)光線通過偏振濾光片后，形成只有一個方向的平面光，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光〔藍(lán)光，485nm〕激發(fā)后，可吸收光能并發(fā)射出相應(yīng)的偏振熒光〔綠光，525～550nm〕，偏振熒光有很強(qiáng)的方向性。

AgF分子小，轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱

AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強(qiáng)

待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比

方法評價

熒光偏振免疫測定樣品用量少；熒光素標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，使用壽命長；方法重復(fù)性好；快速，易自動化；試劑盒專屬性強(qiáng)，適于檢測小分子和中等分子物質(zhì)，不適宜測定大分子物質(zhì)。熒光酶免疫測定

某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光

〔nm〕熒光

〔nm〕堿性磷酸酶4-MUP4-MU360450〔藍(lán)〕β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU360450辣根過氧化物酶HPA二聚體317414〔紫〕注：4-MUP〔4-甲基傘酮磷酸鹽〕；4-MUG〔4-甲基傘酮-β-半乳糖苷〕；4-MU〔4-甲基傘酮〕；HPA〔對羥基苯丙酸〕方法類型

1.雙抗體夾心法：固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體

2.雙抗原夾心法：固相抗原-待測抗體-酶標(biāo)記抗原

3.固相抗原競爭法：待測抗原+固相抗原+定量酶標(biāo)記抗體

方法評價

熒光酶免疫測定由于使用酶和熒光底物的化學(xué)反響作為放大系統(tǒng)，故靈敏度大大提高。

背景熒光會干擾測定，用固相熒光酶免疫測定法效果好。

熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用

1.自身抗體檢測，輔助診斷自身免疫性疾病。

2.病原體檢測，用于疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和臨床回憶診斷。

3.免疫病理檢測，用于組織中抗原、抗體的鑒定。

4.細(xì)胞外表抗原和受體檢測。

熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析。在這種分析法中檢測儀器不是熒光顯微鏡，檢測對象不是固定了的標(biāo)本，而是將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激光照射后發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計(jì)檢測，并自動處理各種數(shù)據(jù)。

二、熒光免疫測定的應(yīng)用

時間分辨熒光免疫測定應(yīng)用范圍十分廣泛，包括蛋白質(zhì)、激素、藥物、腫瘤標(biāo)志物、病原體抗原/抗體等；熒光偏振免疫測定特別適用于血清或尿液中小分子物質(zhì)的測定；熒光酶免疫測定可用于多種抗原抗體的檢測?！玖?xí)題】目前使用最廣泛的熒光色素為

A.FITC

B.RB200

C.TRITC

D.R-RE

E.Eu3+

『正確答案』A

『答案解析』目前使用最廣泛的熒光色素為FITC?！玖?xí)題】RB200產(chǎn)生的熒光色澤為

A.橘紅色

B.黃綠色

C.藍(lán)紫色

D.天青色

E.褐黑色

『正確答案』A

『答案解析』RB200產(chǎn)生的熒光色澤為橘紅色?！玖?xí)題】熒光抗體間接法可檢測

A.抗原

B.抗體

C.補(bǔ)體

D.蛋白質(zhì)

E.抗原和抗體

『正確答案』E

『答案解析』熒光抗體間接法可檢測抗原和抗體?！玖?xí)題】主要用于測定各種激素、蛋白質(zhì)、酶、藥物及病毒抗原的技術(shù)

A.熒光偏振免疫測定

B.熒光免疫顯微技術(shù)

C.時間分辨熒光免疫測定

D.底物標(biāo)記熒光免疫測定

E.流式熒光免疫技術(shù)

『正確答案』C

『答案解析』時間分辨熒光免疫測定主要用于測定各種激素、蛋白質(zhì)、酶、藥物及病毒抗原。【習(xí)題】最適合于時間分辨熒光免疫測定的熒光物質(zhì)

A.異硫氰酸熒光素

B.四乙基羅丹明

C.四甲基異硫氰酸羅丹明

D.藻紅蛋白

E.鑭系稀土元素〔Eu〕

『正確答案』E

『答案解析』最適合于時間分辨熒光免疫測定的熒光物質(zhì)是鑭系稀土元素〔Eu〕?！玖?xí)題】關(guān)于直接法熒光抗體染色的特點(diǎn)，錯誤的選項(xiàng)是

A.簡單易行，特異性高

B.敏感度偏低

C.非特異性熒光染色因素少

D.可檢測抗原及抗體

E.每檢測一種抗原需制備一種相應(yīng)的熒光抗體

『正確答案』D

『答案解析』間接法可以用于檢測抗原和抗體，不是直接法。酶免疫技術(shù)第01講酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)是將抗原抗體反響的特異性和酶高效催化反響的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。

酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)

酶免疫技術(shù)的分類

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶免疫測定的應(yīng)用

既保存了抗體或抗原的免疫學(xué)活性，又保存了酶對底物的催化活性和生物放大作用?？赏ㄟ^酶對底物的顯色反響，對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析，提高了抗原抗體反響的敏感性。

酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)

既保存了抗體或抗原的免疫學(xué)活性，又保存了酶對底物的催化活性和生物放大作用?？赏ㄟ^酶對底物的顯色反響，對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析，提高了抗原抗體反響的敏感性。

酶和酶作用底物

〔一〕酶的要求

一個酶蛋白分子每分鐘可催化103～104個底物分子轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)記抗體或抗原建立酶免疫測定法，可使免疫反響的結(jié)果得以放大，保證測定方法的靈敏度，為此用于標(biāo)記的酶應(yīng)符合以下要求：

1.酶的活性要強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率高，純度高。

2.易與抗體或抗原偶聯(lián)，活性保持穩(wěn)定。

3.作用專一性強(qiáng)，無內(nèi)源性酶或抑制物。

4.易于判斷或測量，方法簡單、敏感和重復(fù)性好。

5.無害，易得。〔二〕常用的酶

1.辣根過氧化物酶〔HRP〕；

HRP來源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由無色的糖蛋白〔主酶〕和亞鐵血紅蛋白〔輔基〕結(jié)合而成的復(fù)合物。輔基是酶活性基團(tuán)，最大吸收峰在波長403nm處；而主酶那么與酶活性無關(guān)，最大吸收峰在275nm。HRP的純度用RZ表示，它是以HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值來表示的。用于酶免疫技術(shù)的HRP，其RZ值應(yīng)大于3.0。RZ值僅說明血紅素基團(tuán)在HRP中的含量，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無關(guān)。

2.堿性磷酸酶〔AP〕

AP是一種磷酸脂水解酶，可以從大腸桿菌或小牛腸黏膜提取，但兩種來源的AP理化性質(zhì)有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最適pH為8.0；腸黏膜AP分子量為100kD，最適pH為9.6；后一種AP的活性高于前者。

3.β-半乳糖苷酶〔β-Gal〕。

〔三〕常用的底物

1.鄰苯二胺〔OPD〕：是ELISA中應(yīng)用最早的底物，HRP的敏感底物之一。在HRP的作用下顯橙黃色，加強(qiáng)酸終止反響后呈棕黃色，最大吸收峰在492nm波長。但穩(wěn)定性差，易變色，具有致癌性。

2.四甲基聯(lián)苯胺〔TMB〕：HRP新型底物。經(jīng)HRP作用后變?yōu)樗{(lán)色，參加硫酸終止反響后變?yōu)辄S色，最大吸收峰波長為450nm。TMB具有穩(wěn)定性好，成色無需避光，無致突變作用等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是水溶性相對較差。

3.對-硝基苯磷酸脂〔p-NPP〕：p-NPP經(jīng)堿性磷酸酶作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

4.4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷〔4-MUU〕：β-半乳糖苷酶〔β-Gal〕的底物。酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物4-甲基傘酮〔4-MU〕，其敏度性較HRP高30～50倍，但測量時需用熒光計(jì)。酶標(biāo)記抗體或抗原

標(biāo)記方法要求：技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，且重復(fù)性好；標(biāo)記反響不影響酶和抗原或抗體的活性；酶標(biāo)志物穩(wěn)定。

常用的標(biāo)記方法有戊二醛交聯(lián)法和改進(jìn)過碘酸鈉法兩種。

常用的純化方法有葡聚糖凝膠G-200／G-150過柱層析純化和50%飽和硫酸銨沉淀提純等。鑒定包括酶活性和抗體〔抗原〕的免疫活性鑒定。

固相載體

要求：結(jié)合抗體或抗原的容量大；牢固地固定抗原或抗體；不影響抗體或抗原的免疫反響性，固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)。種類：

1.塑料制品：聚苯乙烯塑料，物理吸附；

2.微粒：帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能基團(tuán)，易與抗體〔抗原〕形成化學(xué)偶聯(lián)；

3.膜載體：常有硝酸纖維素膜〔Nc〕、玻璃纖維素膜等微孔濾膜，物理吸附。

包被與封閉：

包被的蛋白質(zhì)濃度過低，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除干擾。

酶免疫技術(shù)的分類

均相酶免疫測定

利用酶標(biāo)志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變的原理，可以在不將結(jié)合和游離酶標(biāo)志物別離的情況下，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。

最早取得臨床實(shí)際應(yīng)用的均相酶免疫試驗(yàn)是酶放大免疫測定技術(shù)〔EMIT〕，隨著新的均相酶免疫試驗(yàn)的開展，目前最為成功的是克隆酶供體免疫測定〔CEDIA〕。

〔一〕酶放大免疫測定技術(shù)〔EMIT〕

常用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和溶菌酶。

酶放大免疫測定技術(shù)〔EMIT〕：EMIT的根本原理是半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保存半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受到影響而活性被抑制。反響后酶活力大小與標(biāo)本中的半抗原量呈一定的比例，從酶活力的測定結(jié)果就可推算出標(biāo)本中半抗原的量。〔二〕克隆酶供體免疫分析〔CEDIA〕

基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的B-D-半乳糖苷酶片段：EA+ED。

主要用于藥物和小分子物質(zhì)的測定。

克隆酶供體免疫分析〔CDEIA〕DNA重組技術(shù)可分別合成某種功能酶〔如P-D半乳糖苷酶〕分子的兩個片段，大片段稱為酶受體〔EA〕，小分子稱作酶供體〔ED〕，兩者單獨(dú)均無酶活性，一定條件下結(jié)合形成四聚體方具酶活性。異相酶免疫測定

〔一〕異相液相酶免疫測定

將酶標(biāo)抗原、待測抗原與特異性抗體同時混合〔平衡法〕，或先將待測抗原與特異性抗體混合反響一定時間后，再參加酶標(biāo)抗原〔非平衡法〕，抗原抗體反響到達(dá)平衡后，參加二抗，經(jīng)離心沉淀，將游離的酶標(biāo)記物與結(jié)合的酶標(biāo)記物別離，測定沉淀物中酶的活性。

〔二〕固相酶免疫測定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)〔ELISA〕。ELISA根本原理

免疫反響，包括抗原、抗體、酶標(biāo)記物之間的反響；

酶與底物反響，可以使用不同的酶/底物系統(tǒng)；

檢測方法的建立，利用各種分析方法對酶催化反響的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。ELISA方法類型

檢測抗原的方法

雙抗體夾心法

屬于非競爭結(jié)合測定，是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。其根本原理是先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；參加待測標(biāo)本并溫育，使標(biāo)本中的抗原與固相抗體充分反響，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合物；然后參加酶標(biāo)抗體并溫育。使固相抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體一待測抗原一酶標(biāo)記抗體復(fù)合物〔雙抗體夾心〕，洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)記抗體；加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反響的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量檢測。

雙位點(diǎn)一步法

在雙抗體夾心法根底上，進(jìn)一步開展了雙位點(diǎn)一步法。該法是針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠(yuǎn)的決定簇的兩種單克隆抗體，即包被使用一種單抗，酶標(biāo)記使用另一種單抗。

競爭法

主要用于測定小分子抗原。大分子抗原因其具兩個以上的抗原決定簇，多采用雙抗體夾心法測定，而小分子半抗原〔藥物、激素等〕只有一個抗原決定簇，只能采用競爭法測定。

間接法

間接法檢測抗體最常用的方法，屬非競爭性結(jié)合試驗(yàn)。

雙抗原夾心法

捕獲法

又稱反向間接法。主要用于血清中某種抗體亞型成分〔如IgM〕的測定，目前最常用的是病原體急性感染診斷中的IgM型抗體。

酶免疫測定的應(yīng)用

幾乎所有的可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用酶免疫測定檢測。具有高度的敏感性和特異性，操作簡便以及試劑穩(wěn)定，對環(huán)境沒有污染，已經(jīng)成為臨床免疫檢驗(yàn)中的主導(dǎo)技術(shù)?！玖?xí)題】HRP的活性基團(tuán)是

A.糖蛋白

B.亞鐵血紅素

C.白蛋白

D.球蛋白

E.色氨酸

『正確答案』B

『答案解析』HRP的活性基團(tuán)是亞鐵血紅素。【習(xí)題】以下酶-底物-顏色反響組合中，正確的選項(xiàng)是

A.HRP-OPD-藍(lán)色

B.HRP-TMB-紅色

C.AP-p-NPP-黃色

D.HRP-p-NPP-藍(lán)色

E.AP-TMB-藍(lán)色

『正確答案』C

『答案解析』對-硝基苯磷酸脂p-NPP經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色。【習(xí)題】EMIT測定可以測定

A.大分子抗原

B.小分子抗原或半抗原

C.補(bǔ)體

D.PCAb

E.MCAb

『正確答案』B

『答案解析』EMIT測定小分子抗原或半抗原?！玖?xí)題】反響結(jié)束時，陰性對照管的呈色最強(qiáng)，常見于

A.雙抗體夾心法ELISA

B.競爭法ELISA

C.間接法ELISA

D.捕獲法ELISA

E.雙抗原夾心法ELISA

『正確答案』B

『答案解析』競爭法ELISA反響結(jié)束時，陰性對照管的呈色最強(qiáng)?！玖?xí)題】間接法ELISA中，形成的免疫復(fù)合物是

A.固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗

B.固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體

C.固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體

D.固相抗體-酶標(biāo)抗原

E.固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原

『正確答案』A

『答案解析』間接法ELISA中，形成的免疫復(fù)合物是固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗。【習(xí)題】ELISA雙抗體夾心法是

A.酶標(biāo)記特異抗體用于抗原的檢測

B.先將待測抗原包被于固相載體

C.標(biāo)記一種抗體可檢測多種抗原

D.能用于半抗原的測定

E.屬競爭結(jié)合測定

『正確答案』A

『答案解析』ELISA雙抗體夾心法是酶標(biāo)記特異抗體用于抗原的檢測?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第01講化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反響相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。兼有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反響的高特異性。概述

發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)〔較低能級〕躍遷到激發(fā)態(tài)〔較高能級〕，然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。

化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別是形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能不同。

化學(xué)發(fā)光

某些物質(zhì)〔發(fā)光劑〕在化學(xué)反響時，吸收了反響過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反響的產(chǎn)物分子或反響的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)

化學(xué)發(fā)光劑的條件

①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②物理、化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反響的結(jié)果；⑤對生物體沒有毒性。

化學(xué)發(fā)光劑

〔一〕直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反響，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。

〔二〕酶促反響發(fā)光劑

利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑〔底物〕發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反響發(fā)光劑。目前化學(xué)發(fā)光酶免疫分析中常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶〔HRP〕和堿性磷酸酶。辣根過氧化物酶催化的發(fā)光劑為魯米諾及其衍生物；堿性磷酸酶催化的發(fā)光底物為AMPPD。

3-〔2-螺旋金剛烷〕-4-甲氧基-〔3-磷氧?！?苯基-1,2-二氧乙烷〔AMPPD〕發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)

〔一〕常用標(biāo)記方法

1.碳二亞胺縮合法。

2.過碘酸鈉氧化法。

3.重氮鹽偶聯(lián)法。

4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法?！捕秤绊憳?biāo)記的因素

1.發(fā)光劑的選擇、被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)。

2.標(biāo)記方法的選擇。

3.原料比、標(biāo)記率。

4.溫度。

5.純化與保存。

化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型

化學(xué)發(fā)光免疫分析〔CLIA〕是將化學(xué)發(fā)光與免疫反響相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。CLIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、無放射性危害等優(yōu)點(diǎn)。

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析

吖啶酯反響簡單快速，不需催化劑；

發(fā)光迅速，背景噪音低，保證了敏感性；

與抗原/抗體結(jié)合穩(wěn)定，不影響其活性和理化特性；

瞬間發(fā)光，持續(xù)時間短，對信號檢測儀的靈敏度要求高。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析〔CLEIA〕

是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反響的酶如辣根過氧化物酶〔HRP〕或堿性磷酸酶〔ALP〕來標(biāo)記抗體〔或抗原〕，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原〔抗體〕發(fā)生免疫反響后，形成固相包被抗體一待測抗原一酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，參加底物〔發(fā)光劑〕，酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至?jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。

屬酶免疫測定范疇，測定過程與ELISA相似；

酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定；

酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時間長，便于記錄和測定。電化學(xué)發(fā)光免疫分析

可周而復(fù)始地發(fā)光，持續(xù)時間長，信號強(qiáng)度高，容易測定，容易控制；

三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原/抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的理化特性；

試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好。臨床應(yīng)用

由于化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)無放射性污染，同時能到達(dá)放射免疫測定的靈敏度，而且還具有快速、準(zhǔn)確、特異、可自動化等特點(diǎn)，因此已廣泛應(yīng)用于各種激素、腫瘤標(biāo)志物、藥物濃度及其他微量生物活性物質(zhì)的測定。常用的HRP發(fā)光底物為

A.魯米諾或其衍生物

B.AMPPD

C.TMB

D.吖啶酯

E.三聯(lián)吡啶釕

『正確答案』A

『答案解析』常用的HRP發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物。直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的標(biāo)記物為

A.堿性磷酸酶

B.三聯(lián)吡啶釕[Rubpy〕3]2+

C.吖啶酯

D.魯米諾

E.魯米諾衍生物

『正確答案』C

『答案解析』直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的標(biāo)記物為吖啶酯。關(guān)于電化學(xué)發(fā)光免疫分析，以下描述錯誤的選項(xiàng)是

A.由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反響

B.包括了電化學(xué)反響和光致發(fā)光兩個過程

C.化學(xué)發(fā)光劑主要是三聯(lián)吡啶釕[Rubpy〕3]2+

D.有雙抗體夾心法、固相抗原競爭法等模式

E.以磁性微珠作為別離載體

『正確答案』B

『答案解析』電化學(xué)發(fā)光免疫分析包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。關(guān)于電化學(xué)發(fā)光免疫測定檢測血清HCG含量，以下描述錯誤的選項(xiàng)是

A.常用的檢測方法是雙抗體夾心法

B.常用磁珠別離技術(shù)

C.標(biāo)記物是ALP-抗HCG抗體

D.B/F別離劑是抗HCG抗體包被的磁顆粒

E.發(fā)光反響需要三丙胺參與

『正確答案』C

『答案解析』電化學(xué)發(fā)光免疫測定HCG標(biāo)記物應(yīng)該是三聯(lián)吡啶釕。生物素-親和素放大技術(shù)第01講生物素-親和素放大技術(shù)生物素與親和素之間結(jié)合的親和力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及兩者在結(jié)合反響時具有的多級放大作用等優(yōu)越性。

生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)

生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用

生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

生物素〔biotin，B〕廣泛分布于動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD。

活化生物素

利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，使之容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)志物。包括能標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基、醛基、巰基和核酸的活化生物素。

常用于標(biāo)記核酸分子的活化生物素有以下幾種：

1.光敏生物素它是一種化學(xué)合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的標(biāo)記。

2.生物素脫氧核苷三磷酸先將生物素與某種脫氧核苷酸連接成活化生物素?？刹捎萌笨谝莆环〒饺氲诫p鏈DNA中。

3.BNHS和BHZ二者均可以在一定條件下與核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交聯(lián)，使核酸分子生物素化。生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)

〔一〕生物素化蛋白質(zhì)衍生物

有兩類，一種是生物素化的大分子活性物質(zhì)〔如抗原、抗體〕，另一種是標(biāo)記材料〔如酶〕結(jié)合生物素后制成的標(biāo)志物。而且一個蛋白質(zhì)分子可連接多個生物素分子，從而使其具有較高的比活性，在與親和素的反響中成為多價。生物素化大分子的多價性，是BAS多級放大作用的物質(zhì)根底。生物素化蛋白質(zhì)衍生物有兩類，一種是生物素化的大分子活性物質(zhì)〔如抗原、抗體〕，另一種是標(biāo)記材料〔如酶〕結(jié)合生物素后制成的標(biāo)志物。

〔二〕標(biāo)記考前須知

1.選擇正確的活化生物素和反響條件；

2.應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，以免影響被?biāo)志物的活性；

3.可在生物素與被標(biāo)志物間參加交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)；

4.不影響被標(biāo)記物的免疫活性。

親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

親和素〔AV〕和鏈霉親和素〔SA〕是生物親和素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以與之結(jié)合。

親和素及其活性

常從卵白蛋白中提?。?/p>

四聚體，可結(jié)合4個生物素分子；

性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱、耐多種蛋白水解酶作用。

鏈霉親和素及其活性

由鏈霉菌分泌的蛋白質(zhì)；

可結(jié)合4個生物素分子。

鏈霉親和素〔SA〕因外表所帶正電荷少，且不含糖基，在實(shí)驗(yàn)中的非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于親和素。

親和素〔或鏈霉親和素〕的標(biāo)記

用于標(biāo)記親和素或鏈霉親和素的小分子示蹤物有125Ⅰ、膠體金、熒光素和化學(xué)發(fā)光物，大分子物質(zhì)如酶、抗原或抗體、鐵蛋白和熒光蛋白等，其中最常用的是酶、異硫氰酸熒光素〔FITC〕和膠體金。

生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)

BAS結(jié)合的多級放大作用，既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料，用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)，用于上述各類反響體系中反響物的別離、純化。BAS在實(shí)際應(yīng)用中所具有的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

靈敏度

1.生物素結(jié)合后，保持了大分子物質(zhì)的原有生物活性，而且比活度高，具多價性。

2.多級放大作用，使其在應(yīng)用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。

特異性

1.親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反響呈高度專一性。

2.最大限度地降低反響試劑的非特異作用。

穩(wěn)定性

1.親和素與生物素間的親和常數(shù)比抗原抗體反響至少高1萬倍，呈不可逆反響性。

2.產(chǎn)物的穩(wěn)定性高，從而可降低操作誤差，提高測定的精確度。

適用性

1.用于多種生物學(xué)反響體系；

2.高工作效價，可降低抗體用量，節(jié)約本錢；

3.生物素化標(biāo)記物穩(wěn)定性好，有效期長。

生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用

BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測自動化分析做出了極大的奉獻(xiàn)。此外在核酸探針標(biāo)記、細(xì)胞和生物活性物質(zhì)別離提純等方面也顯示了明顯的優(yōu)越性。生物素-親和素系統(tǒng)根本類型及原理

1.BAB法

BAB法也稱為橋聯(lián)親和素-標(biāo)記生物素法〔BRAB〕，是以游離的親和素〔或鏈霉親和素〕作為橋聯(lián)劑，利用親和素的多價性，將檢測反響體系中抗原-生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素〔如酶標(biāo)生物素〕連接起來，到達(dá)檢測反響分子的目的。

2.ABC法

ABC法是在BAB法根底上的改進(jìn)，其原理是預(yù)先按一定比例將親和素〔或鏈霉親和素〕與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成可溶性的親和素〔或鏈霉親和素〕-生物素-過氧化物酶復(fù)合物〔ABC或SABC〕。當(dāng)其與檢測反響體系中的生物素化抗體〔直接法〕或生物素化第二抗體〔間接法〕相遇時，ABC〔或SABC〕中未飽和的親和素〔或鏈霉親和素〕結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反響體系與ABC〔或SABC〕標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測。

親和素-生物素-E3.BA法

BA〔或LAB〕法是以標(biāo)記親和素〔或鏈霉親和素〕直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測。

生物素-親和素系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用

1.標(biāo)記物穩(wěn)定，試劑有效期長；

2.靈敏度高，特異性強(qiáng)；

3.自動化程度高，檢測菜單齊全。習(xí)題每個親和素能結(jié)合多少個分子的生物素

A.1

B.2

C.3

D.4

E.5

『正確答案』D

『答案解析』每個親和素能結(jié)合4個分子的生物素。生物素-親合素系統(tǒng)〔BAS〕的特點(diǎn)不包括

A.親合素分子可以結(jié)合4個生物素分子

B.反響受抗原抗體比例影響較大

C.親合素和生物素有極強(qiáng)的親和力，起多級放大作用的特異性

D.親合素易與酶、鐵蛋白、熒光素、核素結(jié)合

E生物素易與抗體、酶、多聚核苷酸結(jié)合

『正確答案』B

『答案解析』BAS用于微量抗原抗體及受體的定量定性檢測及定位觀察研究?？乖贵w的比例對其影響不大。