高效液相色譜操作知識(shí)

高效液相色譜操作知識(shí)（一）高壓恒流泵的維護(hù)注意事項(xiàng)泵的密封圈是最易磨損的部件，密封圈的損壞可引起系統(tǒng)的許多故障，要注意保養(yǎng)和定期更換。應(yīng)采取下列措施以延長(zhǎng)使用壽命：絕對(duì)不允許在沒(méi)有流動(dòng)相的或流動(dòng)相還沒(méi)有進(jìn)入泵頭的情況下啟動(dòng)泵而造成柱塞桿的干磨。每天使用后應(yīng)將整個(gè)系統(tǒng)管路中的緩沖液體沖洗干凈，防止鹽沉積，整個(gè)管路要浸在無(wú)緩沖的溶液或有機(jī)溶劑中。長(zhǎng)期不用也要定期開泵沖洗整個(gè)管路。要用HPLC級(jí)試劑輸液管前端要用燒結(jié)不銹鋼沉子過(guò)濾流動(dòng)相。要注意防止管路阻塞造成壓力過(guò)高而損壞儀器。壓力下限應(yīng)設(shè)置在0.5~1MPa,以防止儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被抽干或嚴(yán)重滲漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高壓恒流泵還要注意保持清洗液，否則將失去柱后清洗效果。（二）流動(dòng)相使用的注意事項(xiàng)必須使用HPLC級(jí)或相當(dāng)于該級(jí)別的流動(dòng)相，并要先經(jīng)0.45?m薄膜過(guò)濾。過(guò)濾后的流動(dòng)相必須經(jīng)過(guò)充分脫氣，以除去其中溶解的氣體（如02）,如不脫氣易產(chǎn)生氣泡,增加基線噪聲，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。幾種脫氣方法比較：1、 氨氣脫氣法：利用液體中氨氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氨脫氣，效果較好但成本高。2、 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。3、 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相4、 超聲脫氣法：一種較為常見(jiàn)的脫氣法。流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波震蕩10~15分鐘，此法效果并不太好但操作簡(jiǎn)單。如果管路中使用peek樹脂部件，請(qǐng)不要使用下列流動(dòng)相：濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氫咲喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亞硯特別注意HPLC使用過(guò)后的系統(tǒng)清洗：含有緩沖鹽溶液的流動(dòng)相的清洗方法：1、 先用100%的純水沖洗，打開排放閥，用3~5ml/min的流量，洗二十分鐘左右后停泵。此舉主要是針對(duì)吸液系統(tǒng)、泵頭、進(jìn)出口單向閥等體積較大的空間的清洗2、 再用5：95的甲醇冰清洗整個(gè)系統(tǒng)，關(guān)閉排放閥，用1ml/min的流量，洗30~60分鐘后停泵。此舉主要是用水清洗整個(gè)系統(tǒng)中的鹽，用5%的甲醇主要是為了保護(hù)色譜柱。3、 最后用100%的甲醇清洗整個(gè)系統(tǒng)，用1ml/min的流量，洗2分鐘左右，然后關(guān)機(jī)。如果流動(dòng)相中不含鹽，則使用上述第三步清洗即可。（三）流動(dòng)相的更換在分析過(guò)程中，有時(shí)需要更換流動(dòng)相進(jìn)行分析。一定要注意前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相是不是能夠相溶。如果前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相不能夠相溶，那您就要特別注意了。要采用一種與這二種需更換的流動(dòng)相都能相溶的流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾、清洗。較為常用的過(guò)濾流動(dòng)相為異丙醇，但實(shí)際操作中要看具體情況而定，原則就是采用與這二種需更換的流動(dòng)相都能相溶的流動(dòng)相。一般清洗時(shí)間為30~40分鐘，直至系統(tǒng)完全穩(wěn)定。如不進(jìn)行以上“特別注意”上述步驟的操作，將會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)管路阻塞。嚴(yán)重時(shí)將引起流通池污染堵塞，不得不更換流通池。用戶就要承擔(dān)不必要的損失了。儲(chǔ)液器的注意事項(xiàng)：保持流動(dòng)相儲(chǔ)液器的清潔是保證儀器正常使用的關(guān)鍵。要使用HPLC級(jí)的溶劑，對(duì)試劑含有緩沖鹽及非HPLC級(jí)的流動(dòng)相一定要用0.45?m過(guò)濾器除區(qū)去其中的微量物質(zhì)。儀操作步驟1）、過(guò)濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。2） 、對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3） 、打開液相色譜工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。4） 、進(jìn)入液相色譜儀控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。5） 、有一段時(shí)間沒(méi)用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過(guò)10ml/min。6） 、調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過(guò)2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。7） 、設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取se-lectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊newmethodo選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。8）、進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過(guò)濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9） 、關(guān)液相色譜儀時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。10） 、填寫登記本，由負(fù)責(zé)人簽字。注意事項(xiàng)：1） 、流動(dòng)相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動(dòng)相要小心振動(dòng)盡量不引起氣泡。2） 、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過(guò)柱子。3） 、所有過(guò)柱子的液體均需嚴(yán)格的過(guò)濾。高效液相色譜儀（Agilent1100）操作注意事項(xiàng)---流動(dòng)相：1、 流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭?、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、 水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；3、 使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。樣品：1、 采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、 用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤海M量用流動(dòng)相制備樣品液；手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3?5倍；色譜柱：1、 使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等;2、 使用符合要求的流動(dòng)相；3、 使用保護(hù)柱；4、 如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5%甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；6、 不要高壓沖洗柱子；7、 不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過(guò)程中注意輕拿輕放。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備事項(xiàng)1.1對(duì)照品的配制1.1.1配制方法取干燥情況下的對(duì)照品（注意是否吸潮），每次稱取量不得少于5mg，置一定容量量瓶中，加入少量溶劑，超聲溶解冷卻后再定容、混勻（高濃度）再用移液管吸取1~2ml至先配制成高濃度的對(duì)照品，一定容量量瓶中，加入溶劑定容、混勻，即得（低濃度）配置后的對(duì)照品均需用圭寸口膜圭寸好。1.1.2配制濃度嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配制對(duì)照品濃度（低濃度），不可超過(guò)或低于一倍。1.1.3所需玻璃儀器和容器所需玻璃儀器和容器，盡量選用棕色容量瓶進(jìn)行配制。每次臨用前需要用純水清洗干凈后，再用無(wú)水乙醇沖洗三次，陰（烤）干、冷卻后方可使用。1.1.4標(biāo)簽配制好的對(duì)照品標(biāo)簽上應(yīng)注明：品名、批號(hào)、取樣量、稀釋倍數(shù)（濃度）、配制日期。1.1.5干燥器干燥器中的干燥劑每月至少處理一次。1.2供試品的制備1.2.1取樣方法成品：取10袋裝量差異項(xiàng)下的樣品，按照相關(guān)品種標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下有關(guān)要求，精密稱取兩份，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。藥材：取樣袋中藥材全部打粉至規(guī)定目數(shù)（一般為3?4號(hào)篩），按照05年版中國(guó)藥典相關(guān)品種含量測(cè)定項(xiàng)下有關(guān)要求，精密稱取兩份，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。1.2.2稱樣要求用萬(wàn)分之一天平稱取，使用中注意天平穩(wěn)定。1.2.3量取要求均用移液管量取或刻度量管。1.2.4所需玻璃儀器和容器所需玻璃儀器和容器，每次臨用前需要用純水清洗干凈后，再用無(wú)水乙醇沖洗三次，陰（烤）干、冷卻后方可使用。2實(shí)驗(yàn)中注意事項(xiàng)2.1實(shí)驗(yàn)儀器的準(zhǔn)備2.1.1儀器安裝后是否存在漏液現(xiàn)象？壓力是否穩(wěn)定？柱子是否安反？2.1.2檢查完畢后，打開電腦、N2000工作站電源開關(guān)后，再打開泵電源開關(guān)、控制面板上泵開關(guān)。先用色譜甲醇沖洗柱子，等待機(jī)器平穩(wěn)后，再打開檢測(cè)器電源開關(guān)、控制面板上檢測(cè)器開關(guān)。30分鐘后方可進(jìn)針做實(shí)驗(yàn)。2.1.3打開電腦桌面上的N2000在線工作站，選擇通道，設(shè)定保存路徑、波長(zhǎng)（注意控制面板上同樣需要設(shè)置）等實(shí)驗(yàn)信息。2.1.4設(shè)定完畢后，點(diǎn)擊數(shù)據(jù)采集、查看基線、零點(diǎn)校正后，注意觀察電腦左下角電壓值、時(shí)間值波動(dòng)是否正常？電壓不對(duì)：燈是否開啟？如果開啟還有問(wèn)題，就重新開啟工作站或檢測(cè)器。時(shí)間不對(duì)：調(diào)節(jié)采樣頻率（應(yīng)為10幀/秒）2.2流動(dòng)相的配制所需玻璃儀器和容器，每次臨用前需要用純水清洗干凈后，再用無(wú)水乙醇沖洗三次，陰（烤）干、冷卻后方可使用。先抽濾、后超聲（10-15分鐘）2.3測(cè)定法要求2.3.1樣品進(jìn)樣前先混勻，再用0.45?m濾膜過(guò)濾，再混勻后進(jìn)樣。2.3.2對(duì)照品與樣品進(jìn)樣量要盡量保持一致，樣品峰面積與對(duì)照品峰面積盡量保持一致（不要超過(guò)一倍，可適當(dāng)調(diào)整進(jìn)樣量或稀釋倍數(shù)）。2.3.3注意系統(tǒng)評(píng)價(jià)：理論板數(shù)（達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求）、分離度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之間）。2.3.4平行進(jìn)針要求RSDv2%。2.3.5進(jìn)樣針每次改進(jìn)不同樣品或?qū)φ掌窌r(shí)，需用色譜甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超過(guò)進(jìn)樣量位置。2.4儀器使用過(guò)程中注意事項(xiàng)注意機(jī)器異常情況的發(fā)生（聲音），壓力是否過(guò)高（超過(guò)200Bar不可再做實(shí)驗(yàn)），流動(dòng)相是否流空、廢液瓶是否已滿等等。2.5實(shí)驗(yàn)完畢后可用甲醇沖洗一小時(shí)，如果流動(dòng)相中含有酸或緩沖鹽，則先用新鮮純水沖洗0.5小時(shí)，再用甲醇沖洗一小時(shí)。2.6人參、西洋參等含量測(cè)定做波長(zhǎng)小于240nm的樣品時(shí)，注意機(jī)器、柱子一定要加長(zhǎng)沖洗時(shí)間，乙腈則改用進(jìn)口乙腈。2.7保留時(shí)間改變的樣品用于實(shí)驗(yàn)時(shí)間加長(zhǎng)，導(dǎo)致對(duì)照品與樣品保留時(shí)間不一致時(shí)，在實(shí)驗(yàn)最后加進(jìn)一針對(duì)操作過(guò)程：1、開機(jī)操作：（1）、打開電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開計(jì)算機(jī)，打開BootpServer（一般啟動(dòng)時(shí)已打開）；（2） 、自上而下打開個(gè)組件電源，BootpServer里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開工作站（先打開Online）；（3） 、打開沖洗泵頭的10%異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；（4） 、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；（5）、使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。2、 先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命；3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method,勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；4、 使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；5、 溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈；7、 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；8、 使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀TO方器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。1、 操作過(guò)程若發(fā)現(xiàn)壓力很小，則可能管件連接有漏，注意檢查。當(dāng)出現(xiàn)錯(cuò)誤警告（各組件指示燈均為紅色），一般為漏液，其中一個(gè)感應(yīng)器中已有溶劑，漏液故障排除后，擦干，點(diǎn)擊Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再點(diǎn)擊操作界面中的Instrument/SystemOn即可。2、 連接柱子與管線時(shí)，應(yīng)注意擰緊螺絲的力度，過(guò)度用力可導(dǎo)致連接螺絲斷裂。柱接頭處易發(fā)生漏液，可能情況為接頭Fittings中間的管子未和接口處貼緊。不同廠家的管線及色譜柱頭結(jié)構(gòu)有差異，最好不要混用，必要時(shí)可使用PEEK管及活動(dòng)接頭；3、 操作過(guò)程若發(fā)現(xiàn)壓力非常高，則可能管路已堵，應(yīng)先卸下色譜柱，然后用分段排除法檢查，確定何處堵塞后解決。若是保護(hù)柱或色譜柱堵塞，可用小流量流動(dòng)相或以小流量異丙醇沖洗，還可采用小流量反沖的辦法（新柱不提倡），若還是無(wú)法通暢，則需換柱；4、 運(yùn)行過(guò)程中自動(dòng)停泵，可能為壓力超過(guò)上限或流動(dòng)相用完；5、 樣品瓶中樣品較少，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針無(wú)法到達(dá)液面，可采用調(diào)低進(jìn)樣針進(jìn)樣高度的辦法，注意設(shè)置時(shí)不要使進(jìn)樣針碰到瓶底，微量樣品分析應(yīng)使用微量樣品瓶;6、 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針未與樣品瓶瓶口對(duì)準(zhǔn)時(shí)，需重新定位。7、 泵壓不穩(wěn)或流量不準(zhǔn)，可能為柱塞桿密封圈問(wèn)題或sealwash墊圈問(wèn)題，需更換；8、 基線產(chǎn)生不規(guī)則噪聲，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)定或沒(méi)達(dá)到化學(xué)平衡（使其平衡，若用離子對(duì)試劑，在首次使用使需要足夠的時(shí)間和溶劑體積，色譜柱才能達(dá)到足夠的平衡），流動(dòng)相被污染（更換流動(dòng)相，清洗儲(chǔ)液器、過(guò)濾器，沖洗并重新平衡系統(tǒng)）色譜柱被污染（為證明可能的原因更換系統(tǒng)的色譜柱或使用一根同類的被證明性能好的色譜柱），檢測(cè)器不穩(wěn)定；9、 短期有規(guī)則的噪聲，可能原因?yàn)楸脡翰环€(wěn)或泵脈沖，調(diào)節(jié)溶劑不適當(dāng)（如兩種溶劑的互溶性問(wèn)題），泵入口管路松或堵塞，泵太臟，泵柱塞磨損，檢測(cè)器不穩(wěn)定；10、 長(zhǎng)期有規(guī)則噪聲，可能原因?yàn)槭覝夭环€(wěn)（未使用柱溫箱）或使用柱溫箱不當(dāng)；11、 基線漂移，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)或沒(méi)有達(dá)到化學(xué)平衡，室溫不穩(wěn)（未使用柱溫箱），流動(dòng)相污染或分解，柱污染，檢測(cè)池泄漏，系統(tǒng)泄漏，固定相流失（另選流動(dòng)相，另選色譜柱），測(cè)定的波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤（對(duì)溶劑有吸收），樣品組分保留太長(zhǎng)（用強(qiáng)度合適的溶劑清洗色譜柱），檢測(cè)器不穩(wěn)定；12、 每次進(jìn)樣時(shí)的保留時(shí)間不重復(fù)，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)或未達(dá)到化學(xué)平衡，由于氣泡、各部件磨損等原因引起的泵壓或泵脈沖輸液不穩(wěn)定，進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高平衡被破壞，溶劑配比不合適，柱被污染；13、 無(wú)峰，可能原因?yàn)闄z測(cè)器選擇錯(cuò)誤，使用錯(cuò)誤的流動(dòng)相，樣品降解；14、 色譜峰比預(yù)計(jì)的小，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積錯(cuò)誤，檢測(cè)器燈故障，進(jìn)樣問(wèn)題（瓶號(hào)錯(cuò)、進(jìn)樣體積不合適、進(jìn)樣錯(cuò)誤、針頭堵塞）；15、 峰變寬，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高，過(guò)濾器、保護(hù)柱入口、柱入口或連接管路有部分堵塞，檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，進(jìn)樣器問(wèn)題（如閥漏、針頭堵塞或損壞），柱或保護(hù)柱被污染，對(duì)流動(dòng)相來(lái)說(shuō)樣品溶劑太強(qiáng)，使用錯(cuò)誤的色譜柱，溫度變化；16、 出現(xiàn)雙峰/肩峰，可能原因?yàn)楸Ｗo(hù)柱或柱入口部分阻塞，柱或保護(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效，進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高（樣品過(guò)載），平衡破壞；17、 前沿峰，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高（樣品過(guò)載），平衡破壞，對(duì)于流動(dòng)相來(lái)說(shuō)樣品溶劑非極性太強(qiáng)（對(duì)于反相柱），柱或保護(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效；18、 脫尾峰，可能原因?yàn)橹虮Ｗo(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效，進(jìn)樣器問(wèn)題（如閥漏等），檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤；19、 出現(xiàn)鬼峰，可能原因?yàn)榱鲃?dòng)相被污染，樣品預(yù)處理時(shí)產(chǎn)生降解或混入雜質(zhì)，先前進(jìn)樣的流出物，樣品定量管清洗不當(dāng)，注射器臟，柱被污染，進(jìn)樣裝置被污染，流動(dòng)相中含有穩(wěn)定劑/穩(wěn)定劑變化。液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法一、 HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法樣品量不足，解決辦法為增加樣品量樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣。記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。二、 為什么HPLC柱柱壓過(guò)高柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。1.拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查；2.把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3.將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4.更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì),正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題，SGE提供的heodyne7315型過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。三、液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子.四、如何解決HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間發(fā)生漂移或急速變化溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡快速變化現(xiàn)象流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出。6.流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合五、 HPLC儀器問(wèn)題1、 我的HPLC泵壓明顯的偏高，請(qǐng)問(wèn)可能的原因？答：流速設(shè)定過(guò)高；流動(dòng)相或進(jìn)樣中有機(jī)械雜質(zhì)，造成保護(hù)柱、柱前篩板或在線過(guò)濾器阻塞;流動(dòng)相粘度過(guò)大；柱溫過(guò)低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。2、 基線不穩(wěn)，上下波動(dòng)或漂移的原因是什么，如何解決？答：a.流動(dòng)相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氦氣脫氣單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物c?泵密封損壞，造成壓力波動(dòng)；更換泵密封d.系統(tǒng)存在漏液點(diǎn)；確定漏液位置并維修e?流通池有臟物或雜質(zhì)；清洗流通池f?柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負(fù)壓調(diào)整器g?檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處；將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處h?柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)；用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。3、 接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？答：接頭沒(méi)有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手?jǐn)Q緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會(huì)留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。4、 進(jìn)樣閥漏液是如何造成的？答：a?轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封b.定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán)c?進(jìn)樣口密封松動(dòng)；調(diào)整松緊度進(jìn)樣針頭尺寸不合適，一般是過(guò)短；使用恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣針（注意針頭形狀）廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管六、 譜圖問(wèn)題1、問(wèn)：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保護(hù)柱或分析柱污染；取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞,拆下來(lái)清洗。如果問(wèn)題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊?wèn)題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動(dòng)相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。2、 問(wèn)：K'值增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重，這是為什么？答：反相模式，二級(jí)保留效應(yīng)；a?加入三乙胺（或堿性樣品）b?加入乙酸（或酸性樣品）加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）更換一支柱子3、 問(wèn)：保留時(shí)間的波動(dòng)有幾種可能的原因？答：溫控不當(dāng)；調(diào)節(jié)好柱溫。流動(dòng)相組分變化；防止流動(dòng)相蒸發(fā)、反應(yīng)等，做梯度時(shí)尤其要注意流動(dòng)相混合的均勻。色譜柱沒(méi)有平衡；在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。七、 問(wèn)：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法樣品量不足，解決辦法為增加樣品量樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣。記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。八、 問(wèn)：毛細(xì)管色譜分流進(jìn)樣時(shí)，非線性分流的主要原因是什么？1進(jìn)樣器溫度太低，樣品汽化不完全，發(fā)生分級(jí)分流。2進(jìn)樣器溫度太高，某些組分可能發(fā)生熱分解，也有的樣品可能發(fā)生催化分解，或樣品部分地被吸附在進(jìn)樣器內(nèi)表面上。3在分流點(diǎn)以前樣品沒(méi)有混合均勻或混合不充分。4系統(tǒng)的進(jìn)樣墊、柱接頭等地方漏氣。九、 問(wèn)：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？答：原因可能有：泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；比例閥失效，更換比例閥即可；泵密封墊損壞，更換密封墊即可；溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。十、問(wèn)：做PGS/MS分析時(shí)，如何防止焦油狀污染物進(jìn)入毛細(xì)柱？答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及鹵素的高分子裂解時(shí)，常有焦油狀物質(zhì)產(chǎn)生。為防止這種焦油狀物質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)柱造成污染而使柱性能下降，可采用保護(hù)預(yù)柱，即在裂解器與毛細(xì)柱之間接一填充預(yù)柱，通過(guò)控制預(yù)柱溫度而使焦油狀物質(zhì)滯留在預(yù)柱內(nèi)，預(yù)柱可置于GC氣化室內(nèi)，這樣既容易控制溫度，又減少系統(tǒng)的死體積，當(dāng)然，預(yù)柱填料需經(jīng)常更換。十一、問(wèn)：更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？答：這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過(guò)去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺（TEA）,將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和,從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。十二、問(wèn)：購(gòu)買的HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問(wèn)為什么？答：柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查；把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題，SGE提供的Rheodyne7315型過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。十三、問(wèn)：高溫毛細(xì)柱的使用壽命一般為多長(zhǎng)？答：毛細(xì)柱壽命鋤決定于柱子本身的性能外，在很大程度上取決于使用情況，如使用溫度、樣品狀態(tài)，進(jìn)樣量等，如果在其使用溫度范圍內(nèi)，樣品干凈，色譜柱不被污染的情況下，柱子壽命一般在2-3年之間。十四、問(wèn)：BPX70毛細(xì)柱是否可用于GC/MS分析？答：完全可以。BPX70為極性柱，使用溫度范圍寬（25-260C）,程序升溫可達(dá)290C，流失低，適合于分析脂肪酸甲酯的的各種位置和幾何異構(gòu)體，藥物異構(gòu)體，碳水化合物等。因BPX70為交聯(lián)柱，故用于GC/MS很穩(wěn)定，污染后可清洗再生。十五、問(wèn)：如毛細(xì)管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢復(fù)？是否可通過(guò)老化來(lái)解決？答：根據(jù)柱污染程度可采取不同的方法來(lái)解決，如果污染不嚴(yán)重，污染物沸點(diǎn)不是太高，可通過(guò)老化來(lái)解決，但老化溫度不可超過(guò)柱子的最高使用溫度，且一般要較長(zhǎng)時(shí)間（8-30）小時(shí)，如果污染較嚴(yán)重，或通過(guò)老化仍不能使柱性能恢復(fù)，那就必須采用溶劑清洗，通常是用5倍柱容積的溶劑（如正戊烷，二氯甲烷等）通過(guò)色譜柱。當(dāng)然，清洗熔劑用的越多，對(duì)柱性能的損壞越大，清洗完后，在通載氣老化一定時(shí)間，如果柱性能恢復(fù)，便可繼續(xù)使用。必須指出：只有交聯(lián)柱才能清洗，對(duì)于非交聯(lián)柱，清洗柱子會(huì)徹底失效，因?yàn)楣潭ㄒ罕幌吹袅耍劣谇逑从萌蹌┑倪x擇，可參考說(shuō)明書。[/hide]色譜常見(jiàn)故障及排除方法1、 柱壓升高T色譜柱入U(xiǎn)濾片被流動(dòng)相或樣品中顆粒堵住。樣品組分在濾片上沉淀堵住濾片。卸下入口接頭的濾片，使用1：1的硝酸溶液超聲清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份。樣品及流動(dòng)相使用0.45µm濾膜除去微量雜質(zhì)。使用流動(dòng)相作溶劑配制樣品。2、 新柱柱效低F柱外死體積大?樣品在流動(dòng)相中溶解不好，影響傳質(zhì)過(guò)程。更換連接管，重新連接色譜柱，降低死體積。使用合適的流動(dòng)相或使用流動(dòng)相溶解樣品。？3、 舊色譜柱柱效低，分離不好，柱入口床層塌陷。Qt5e（,填料被流動(dòng)相溶蝕而流失。用同型填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。對(duì)硅膠質(zhì)填料，流動(dòng)相PH值在2—7范圍內(nèi)，否則可能被溶蝕。丨4、 舊色譜柱柱效低分離不好，有時(shí)出現(xiàn)雙峰。v入門填料被污染變質(zhì)所致。用強(qiáng)溶劑沖洗。刮除被污染的床層，用同型的填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。污染嚴(yán)重，則廢棄或重新填裝。5、 新柱接到儀器上后，柱頭漏液。E柱接頭與儀器之間連接管的壓環(huán)變形量不夠。用扳手順時(shí)針?lè)较驍Q緊1/4圈直到不漏液為止。，6、 新柱接到儀器上后，啟動(dòng)儀器沒(méi)有柱壓降。Zm柱放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干。繼續(xù)開泵，用流動(dòng)相將柱內(nèi)氣體置換掉。xL77、 新柱接到儀器上后，檢測(cè)器出口不斷有小氣泡出現(xiàn)。S\T①同上。②流動(dòng)相脫氣不徹底特別是MeOH/H20體系由于氫鍵作用很容易出現(xiàn)氣泡。①司上。②配好流動(dòng)相后一定要進(jìn)行脫氣處理。k&新柱接到儀器上后柱壓降不斷增加，甚至超過(guò)儀器的耐壓限。f柱入口濾片被固體顆粒堵塞（或被毒菌堵塞）。更換或清洗柱入口濾片；用0.45µm過(guò)濾膜過(guò)濾流動(dòng)相除去微小顆粒物。X9Ks=x9、 進(jìn)樣次數(shù)增加柱壓降逐漸增加。.①樣品中含有不溶于流動(dòng)相的微小顆粒物。 ②樣品在流動(dòng)相中析出微小結(jié)晶。 ①用0.45µm過(guò)濾膜過(guò)濾樣品。②推薦使用流動(dòng)相溶解樣品。bx10、 使用一段時(shí)間后，柱效下降，分離不好。p①柱填料被流動(dòng)相溶解而流失。②柱填料被樣品雜質(zhì)污染。①推薦使用予柱。如柱床層塌陷,用相同型號(hào)填料填補(bǔ)。②推薦使用保護(hù)柱或用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱除去污染雜質(zhì)。K1）0j11、 柱使用一段時(shí)間后，柱效下降出現(xiàn)雙峰。'tl柱入口床層被污染使柱填料變質(zhì)。用強(qiáng)溶劑沖洗除去雜質(zhì)。c,=O12、 柱使用一段時(shí)間后，柱效下降，出現(xiàn)峰拖尾。柱入口床層被污染。用強(qiáng)溶劑沖洗20-30ml，若效果不明顯應(yīng)廢棄。13、 進(jìn)樣量增大與峰面積增加不成正比.即進(jìn)樣量與峰面積不是線性關(guān)系。樣品在流動(dòng)相中的溶解度小，只有部分樣品被