01 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-凱氏(Kjeldahl)微量定氮法測定血清蛋白質(zhì)含量

凱氏（Kjeldahl）微量定氮法測定血清蛋白質(zhì)含量【目的】1．掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括未知樣品的消化蒸餾、滴定及其含氮量的計算等。2．熟悉微量凱氏定氮法的原理。【原理】凱氏定氮法是蛋白質(zhì)含量測定的經(jīng)典方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)分子中含氮量來測定的，各種蛋白質(zhì)含氮量比較近似，平均約為16％，即1g氮相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)。由測定出的氮量即可換算出蛋白質(zhì)含量。血清蛋白質(zhì)或其它有機(jī)含氮物與濃硫酸加熱進(jìn)行消化(氧化)時，其中碳、氫、氧元素分別被氧化為二氧化碳和水，而氮原子則轉(zhuǎn)變成氨，后者與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在溶液中，為了加速有機(jī)物質(zhì)的氧化分解，在消化時加入硫酸銅做為催化劑，加入硫酸鉀以提高消化液的沸點(diǎn)。硫酸銨與氫氧化鈉作用，放出氨，通過水蒸氣蒸餾將氨帶入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氫離子濃度降低，指示劑顏色發(fā)生改變，用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直至原來溶液中氫離子的濃度恢復(fù)，即指示劑變?yōu)樵瓉淼念伾?。根?jù)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸量，即可計算出樣品中的總氮量?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下：1．消化含氮化合物+H2SO4—→CO2↑+H2O+(NH4)2SO4+SO2↑2．蒸餾(NH4)2SO4+2NaOH—→2NH4OH+Na2SO4NH4OH—→NH3↑+H2O3NH3+H3BO3—→(NH4)3BO33．滴定(NH4)3BO3+3HCl—→3NH4Cl+H3BO3以上測定為樣品中的總氮量，由總氮量減去非蛋白氮，即為蛋白質(zhì)含氮量，再乘以6.25即為血清蛋白質(zhì)含量。【器材】1．電爐2．鐵三角架3．酒精燈4．錐形瓶5．消化管（凱氏燒瓶）6．滴定管7．微量凱氏定氮器8．刻度吸量管9．玻璃珠10．漏斗11．血清【試劑】1．硫酸鉀粉末2．12.5％硫酸銅水溶液3．濃硫酸4．2％硼酸水溶液5．混合指示劑取0.1％溴甲酚綠乙醇溶液10ml與0.1％甲基紅乙醇溶液4ml混合6．30％氫氧化鈉溶液7．0.0lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液【操作】一、消化取消化管二支，標(biāo)明測定管與空白管，按下表進(jìn)行操作：試劑（ml）測定管空白管血清0.10-蒸餾水-0.10K2SO4粉末（g）0.1～0.20.1～0.212.5%CuSO40.30.3濃H2SO41.21.2玻璃珠(個)11混勻，置于電爐上加熱消化（圖3-1），開始有水蒸氣逸出，繼而溶液呈現(xiàn)棕色并冒出白煙(SO3)，此時火力應(yīng)減小，并在管口上蓋一小漏斗，以免硫酸損失過多，再繼續(xù)消化至溶液變?yōu)槌吻宓乃{(lán)綠色，即消化完畢(此過程約需25分鐘左右)，冷卻后加水3.8ml，使總量成為5ml(內(nèi)有1.2ml硫酸)，混勻，準(zhǔn)備蒸餾。圖3-1消化裝置示意圖二、蒸餾1．蒸餾器的結(jié)構(gòu)和用法蒸餾器有多種，但大同小異。用前需熟悉其使用方法。本實(shí)驗(yàn)所用蒸餾器如圖3-2所示：圖3-2微量凱氏定氮器結(jié)構(gòu)示意圖P1為出水開關(guān)，P2為入水開關(guān)，A為蒸氣發(fā)生室，B為蒸餾室，與出氣管M相通。B室內(nèi)有Y形管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P3與漏斗D相連，經(jīng)此可將樣品和試劑加入B室，E為進(jìn)水管，接水龍頭，F(xiàn)為指形冷凝管，H為盛有定量硼酸溶液的錐形瓶，以吸收氨。水經(jīng)E、F、G、K而流出，蒸餾時B室加入消化好的樣品及氫氧化鈉，二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，A室因加熱而產(chǎn)生的水蒸氣經(jīng)Y管進(jìn)入B室，并將氨一起帶出，經(jīng)冷凝由M管進(jìn)入錐形瓶中被酸吸收。將洗干凈的微量凱氏定氮器安裝妥當(dāng)，把E管接水龍頭，并關(guān)閉P1、P2、P3各塞，打開水源，水則由E→F→G→K緩緩流出(水不宜開的過大，以免水從G管溢出)。放開P2，水流入A室，并讓少量水流入B室，然后塞住管口G，放開P1，此時B室內(nèi)水應(yīng)被吸出，否則應(yīng)檢查各接頭處是否漏氣。2．蒸餾（1）打開水籠頭和P2，使水經(jīng)E→F→G→P2進(jìn)入A室，水約至瓶下球形部分的2／3處，即關(guān)閉P2。（2）吸取2％硼酸溶液l0ml，放人l00ml錐形瓶中，加混合指示劑3滴(呈灰紫色)，把錐形瓶置于M管下，并使管口完全進(jìn)入硼酸溶液中。（3）打開P3，吸取消化好的樣品溶液2ml，由漏斗D加入蒸餾室B中，用lml蒸餾水沖洗漏斗，再加入30％氫氧化鈉溶液5ml，立即將P3夾緊(可在漏斗中加少量水封閉，以防漏氣。（4）用酒精燈加熱A室，火焰應(yīng)穩(wěn)定，以免錐形瓶中的溶液倒吸，待硼酸溶液變?yōu)樗{(lán)綠色后再繼續(xù)蒸餾5min。（5）將錐形瓶下移，使M管離開硼酸液面，再繼續(xù)蒸餾1分鐘，最后用蒸餾水1ml沖洗M管外壁，取下錐形瓶進(jìn)行滴定。（6）蒸餾完后應(yīng)立即清洗蒸餾器，其方法是先打開P2，將A室的水充至球形上方，然后塞住G口，放開Pl，B室內(nèi)溶液即被吸出，然后再經(jīng)D加蒸餾水入B室，如上所述吸出B室的水。如此反復(fù)洗滌2～3次。（7）空白管溶液也同樣進(jìn)行蒸餾。三．滴定用0.01mol/L的鹽酸滴定錐形瓶中收集液，使其由藍(lán)色變?yōu)榛易仙?蒸餾前硼酸的顏色)，即為終點(diǎn)，記錄滴定所消耗鹽酸的數(shù)量?！居嬎恪?．式中，A表示滴定樣品用0.01mol／L鹽酸的ml數(shù)；B表示滴定空白用0.01mol／L鹽酸的ml數(shù)；0.14表示1ml0.01mol／L鹽酸相當(dāng)于氮的毫克數(shù)。2．血清蛋白質(zhì)含量（g/L）=式中，NPN表示非蛋白氮，即制備樣品無蛋白濾液中的氮。【注意事項】一、樣品消化注意事項1．加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸。2．消化開始時不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進(jìn)其消化完全。3．樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過程中產(chǎn)生大量泡沫。4．消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。二、蒸餾注意事項1．進(jìn)行蒸餾前必須熟悉儀器特點(diǎn)，P1打開A室水流出；P2打開G管水流入；P3打開漏斗D液體流入B室。蒸餾開始后，P1、P2、P3均需關(guān)閉，定氮處于密閉狀態(tài)，切不可隨意開啟。2．下列因素可導(dǎo)致B室液體壓入A室，同時錐形瓶中的硼酸也可能倒吸入B室，導(dǎo)致定氮的失敗。（1）蒸餾時P3打開，B室壓力增高。（2）蒸餾時酒精燈移開，或火焰時斷時續(xù)，時大時小，A室遇冷，壓力降低。（3）蒸餾時P2打開，水至G管流入A室，A室遇冷壓力降低。3．進(jìn)行蒸餾前必須用水蒸氣充分洗滌蒸餾器，以消除可能殘存的氨。方法是于M管下放一盛有硼酸加指示劑的錐形瓶，若經(jīng)蒸餾，錐形瓶內(nèi)顏色不變，即證明蒸餾器內(nèi)部已經(jīng)洗滌干凈，無氨殘留。4．實(shí)驗(yàn)室環(huán)境忌有堿性霧氣，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5．溴甲酚綠-甲基紅指示劑的變色點(diǎn)為pH5.1，大于5.1呈綠色，硼酸加指示劑應(yīng)為灰紫色，若呈紅色，說明硼酸酸性過強(qiáng)，可用0.1m