發(fā)光的大腸桿菌課件

發(fā)光的大腸桿菌朱靜宇張明石卉.1制備感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒擴(kuò)增質(zhì)粒酶切目的基因序列擴(kuò)增連接轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方案概述.2材料大腸桿菌少量PET28質(zhì)粒（既為原核質(zhì)粒又為真核質(zhì)粒）顯示綠色熒光的PEGFP-N3質(zhì)粒（為真核質(zhì)粒）.3制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

挑取E.coil單菌落接種至2mlSOC培養(yǎng)液，37℃搖床過夜。挑取0.5—1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直至A600達(dá)到0.6，取出水浴10min4℃4000rpm/min10min.同時(shí)冰浴配置TB溶液。棄上清，倒置離心管于濾紙上1mlTB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB溶液冰浴10-15min。4℃4000rpm/min10min去上清，沉淀重懸于4mlTB中，冰浴10min加入280uLDMSO,混合均勻，冰浴10min分裝于EP管中，-80℃或液氮保存檢測感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量（陰性對照）.4質(zhì)粒擴(kuò)增pet28的質(zhì)粒擴(kuò)增PEGFP-N3質(zhì)粒擴(kuò)增搖菌轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒.5轉(zhuǎn)化

取100ul感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化加入1ul

pet28質(zhì)粒和1ulPEGFP-N3質(zhì)粒，輕輕吹勻，冰浴30min將菌液放入42°C水浴熱激90s，立即放入冰浴中2min將菌液2000rmp/min離心3min，留200ul上清液將菌體打散，均勻涂布于含卡那抗性的瓊脂平板，平板于37°C倒置培養(yǎng)過夜。同時(shí)進(jìn)行陽性和陰性對照.6搖菌+提質(zhì)粒

將培養(yǎng)過夜的平板取出，用已滅菌的槍尖挑取平板上單個(gè)的較大的菌落將移液槍尖打入5ml培養(yǎng)基內(nèi)，放入37°C搖床中rpm/min,搖菌16小時(shí)左右運(yùn)用Omega等品牌的試劑盒對菌液進(jìn)行小提用濃度為1%的膠，120V

20min，用10000的marker做對照驗(yàn)證測濃度.7質(zhì)粒的酶切尋找pet28和pegfp-n3的酶切位點(diǎn).8質(zhì)粒的酶切（兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)酶切）確定的酶切位點(diǎn)：EcorR

I、XbaI內(nèi)切酶：Not

I、BamHI內(nèi)切酶Buffer：cutsmart37℃溫育4hours未酶切的質(zhì)粒作對照，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果純化.9010203040506設(shè)計(jì)引物PEGFP-N3目的基因擴(kuò)增PCR電泳膠回收純化測序.10PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物PEGFPN5’

5'TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3'

PEGFPN3’

5’GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3’Primer2Tm68.5°CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient181100.0l/(mol˙cm)

Primer#1Tm57.6°CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient229700.0l/(mol˙cm)SXJ

.11PCR體系premix體系TakaRaTaqdNTPmixturePCRbufferPEGFP-N3<100ngPrimer10.2-1.0uMPrimer20.2-1.0uMddH2O補(bǔ)足50uLPCR反應(yīng)條件95℃3min98℃10s60℃30s72℃1min72℃5min4℃∞循環(huán)35次.12020103加入樣品與buffer混勻，短暫離心孵育22℃

3h連接.130102030405質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化加入質(zhì)粒，混勻，冰浴菌液熱激90s后冰浴2min加SOD，37℃搖菌2000rpm/m