程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老課件

第十一章

（十三）

程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老1第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡第二節(jié)細(xì)胞衰老2

第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡

細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）是指?jìng)€(gè)體發(fā)育中發(fā)生的某類細(xì)胞的大量死亡，而這種死亡要求特定的基因表達(dá)。3一、動(dòng)物細(xì)胞的程序性死亡

二、植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡

4（一）細(xì)胞凋亡（二）細(xì)胞壞死（三）細(xì)胞自噬51.細(xì)胞凋亡的概念和特征細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺行為。6凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)，包括染色質(zhì)固縮，DNA裂解為200bp左右的片段，細(xì)胞皺縮，然后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，最后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬。最重要特征：凋亡過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)膜始終保持完整，形成凋亡小體，不引發(fā)炎癥反應(yīng)。7細(xì)胞凋亡的過(guò)程及特征1、正常細(xì)胞；2、染色質(zhì)固縮、片段化并沿核膜分布，細(xì)胞質(zhì)也發(fā)生濃縮；3、凋亡中的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷，包圍染色質(zhì)片段和細(xì)胞器等，形成芽狀突起并逐漸分隔，形成凋亡小體；4、凋亡小體被鄰近吞噬細(xì)胞吞噬。吞噬細(xì)胞凋亡小體123482、細(xì)胞凋亡的生理意義細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的基本措施。1）保證胚胎的正常發(fā)育。

如蝌蚪尾的消失，指或趾間細(xì)胞的凋亡。2）調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。如調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量使之與靶細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)。3）機(jī)體免疫。殺傷免疫細(xì)胞攻擊被感染細(xì)胞并引起其死亡。4）在成年階段清除衰老和病變的細(xì)胞。910細(xì)胞凋亡與人類疾病細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌等細(xì)胞凋亡增多有關(guān)的疾病自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎早老性遲呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病

113.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法1）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)2）DNA電泳檢測(cè)

3）TUNEL法4）彗星電泳法5）流式細(xì)胞儀法12

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。染色細(xì)胞：常用吉姆薩染色、臺(tái)盼蘭染色。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月?tīng)罡皆诤四ぶ車?。光學(xué)顯微鏡檢測(cè)13一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：

DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）DAPI與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。熒光顯微鏡檢測(cè)14DAPI染色法觀察細(xì)胞凋亡NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm

400）15DNA片段化分析

細(xì)胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180

200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。161:DNAladder2:沒(méi)有用喜樹(shù)堿（CAM）處理的淋巴癌細(xì)胞397株系。3：用喜樹(shù)堿（CAM）處理的淋巴癌細(xì)胞397株系。4：陽(yáng)性對(duì)照。喜樹(shù)堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)17末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法，能對(duì)DNA分子斷裂口中的3’-OH進(jìn)行原位標(biāo)記。借助于熒光標(biāo)記物，可用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。18TUNEL熒光標(biāo)記法觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中的DNA片段化194.細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制誘導(dǎo)凋亡的因子：物理因子：射線、溫度刺激化學(xué)因子：活性氧基團(tuán)和分子、蛋白質(zhì)合成抑制劑凋亡因子：蛋白酶Caspase、腫瘤壞死因子20凋亡方式：1、Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡2、不依賴于Caspase的細(xì)胞凋亡21（1）CaspaseCaspase是天冬氨酸特異性的半光氨酸蛋白水解酶，使靶蛋白活化或失活。它的活性位點(diǎn)包含半胱氨酸殘基，切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid的詞頭，Asp，proteases的詞尾)。22Caspase家族的特點(diǎn)以酶原的形式存在，需要活化，

C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點(diǎn)。

Caspase分為兩類：起始酶和執(zhí)行酶

23（2）Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡

外源性細(xì)胞凋亡產(chǎn)生有活性的caspase3切割凋亡家族蛋白Bid切割執(zhí)行者caspase3酶原胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到細(xì)胞質(zhì)膜上，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）FASL（FAS的配體）+FAS（死亡受體）+FADD（接頭蛋白）剪切的Bid從胞質(zhì)到線粒體線粒體向胞質(zhì)釋放CtyC內(nèi)源性細(xì)胞凋亡24在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中，線粒體處于中心地位。線粒體釋放凋亡因子（包括細(xì)胞色素C，Smac/DIABLO蛋白,凋亡誘導(dǎo)因子AIF，限制性核酸內(nèi)切酶G等），其中最關(guān)鍵的是釋放細(xì)胞色素c。細(xì)胞色素c+凋亡因子Apaf-1+caspase9酶原→凋亡復(fù)合體，活化caspase9活化Caspase325細(xì)胞凋亡的外源和內(nèi)源信號(hào)途徑26

(3)

Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡限制性核酸內(nèi)切酶G凋亡誘導(dǎo)因子27（4）細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞中的Caspase酶原分子像埋藏的定時(shí)炸彈，時(shí)刻準(zhǔn)備被外界信號(hào)引發(fā)，摧毀細(xì)胞。細(xì)胞中存在Caspase抑制因子（IPA),能夠與Caspase結(jié)合，阻抑其對(duì)底物的切割作用。28IPA家族的抗凋亡作用能被特異的凋亡激活因子如Smac/DIABLO蛋白解除。29在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2Bcl-2）家族通過(guò)調(diào)控調(diào)控線粒體外膜通透性而影響細(xì)胞色素C的釋放。30Bcl-2家族：對(duì)細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。分為兩組：抑制細(xì)胞凋亡：

Bcl-2,Bcl-xL,Bcl-w。促進(jìn)細(xì)胞凋亡:Bax,Bad，Bid影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能31

P53與細(xì)胞凋亡P53是腫瘤抑制因子和促凋亡因子。其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。在依賴P53蛋白的細(xì)胞凋亡中，P53蛋白能特異地抑制Bc1-2的表達(dá)，而活化Bax的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。P53基因是人類腫瘤有關(guān)基因中突變頻率最高的基因。32（二）細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死是細(xì)胞程序性死亡的另一種形式，具有包括炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時(shí)，壞死作為凋亡的“替補(bǔ)”方式被細(xì)胞采用。3334

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因子物理、化學(xué)及生物因子極端的物理、化學(xué)刺激及嚴(yán)重的病理刺激膜完整性完整不完整細(xì)胞體積減小增大染色質(zhì)凝聚（成半月?tīng)睿┎荒?稀疏成網(wǎng)狀）溶酶體完整破裂基因組DNA降解成200bp整數(shù)倍片段隨機(jī)降解凋亡小體形成不形成炎癥反應(yīng)不引發(fā)引發(fā)35（三）細(xì)胞自噬通常，壽命較短的蛋白質(zhì)通過(guò)泛素—蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解，而壽命較長(zhǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)則通過(guò)細(xì)胞自噬途徑，由溶酶體進(jìn)行降解。細(xì)胞自噬的特征是細(xì)胞中出現(xiàn)大的雙層膜包裹的自噬泡。36細(xì)胞自噬參與了細(xì)胞死亡過(guò)程，是與細(xì)胞凋亡不同的另一種程序性死亡。細(xì)胞自噬主要發(fā)生在個(gè)體遭遇營(yíng)養(yǎng)危機(jī)的時(shí)候以及胚胎發(fā)育期間。37二、植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡（一）植物細(xì)胞的程序性死亡（二）酵母細(xì)胞的程序性死亡38（一）植物細(xì)胞的程序性死亡在正常的植物發(fā)育進(jìn)程，如導(dǎo)管的分化、通氣組織的形成等過(guò)程，以及對(duì)缺氧、高鹽環(huán)境等脅迫的反應(yīng)，和病原體誘發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)中，均存在細(xì)胞程序性死亡。39能誘發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)的因素主要有活性氧和植物激素等。水楊酸、一氧化氮能協(xié)同促進(jìn)植物過(guò)敏反應(yīng)中的細(xì)胞程序性死亡；乙烯、赤霉素能促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡；細(xì)胞分裂素和脫落酸能抑制細(xì)胞程序性死亡。40（二）酵母細(xì)胞的程序性死亡酵母程序性死亡的機(jī)制以及形態(tài)學(xué)特征與動(dòng)物細(xì)胞凋亡類似；在酵母中發(fā)現(xiàn)了Caspase的類似物。生物學(xué)意義：清除適應(yīng)不良個(gè)體，控制群體數(shù)量。41第二節(jié)細(xì)胞衰老一、細(xì)胞衰老的概念及特征細(xì)胞衰老的一般含義是復(fù)制衰老（RS)。指體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動(dòng)發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。42Hayflick界限：美國(guó)生物學(xué)家Hayflick指出正常體外培養(yǎng)細(xì)胞具有有限分裂次數(shù)，稱為Hayflick界限。細(xì)胞停止分裂是由細(xì)胞自身因素決定的，與環(huán)境條件無(wú)關(guān)，而癌細(xì)胞能夠在體外無(wú)限增殖。43細(xì)胞衰老過(guò)程的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（一）細(xì)胞核變大（二）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彌散分布于核周（三）線粒體數(shù)量減少，體積變大（四）致密體生成（五）細(xì)胞膜由流動(dòng)相變?yōu)槟z相或固相（六）細(xì)胞間隙連接減少44二、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制（一）復(fù)制衰老的機(jī)制端粒的縮短能導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制衰老。其機(jī)制是：腫瘤抑制蛋白P53通過(guò)識(shí)別失去功能的端粒，繼而誘導(dǎo)P21的表達(dá)。P21為CDK抑制因子，可抑制CDK2,C