2023醫(yī)學實驗室核酸檢測質(zhì)量和安全指南

醫(yī)學實驗室核酸檢測質(zhì)量和安全指南目錄前言 2范圍 3規(guī)范性引用文件 3總則 3基于擴增的核酸檢測程序 4手工核酸提取純化及檢測方法 4工作流程 4設(shè)施設(shè)備與環(huán)境 4質(zhì)量控制關(guān)鍵點 6安全管理 8全自動核酸提取純化及檢測方法 10工作流程 10設(shè)施設(shè)備與環(huán)境 10質(zhì)量控制關(guān)鍵點 安全管理 12全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng) 12工作流程 12設(shè)施設(shè)備與環(huán)境 12質(zhì)量控制關(guān)鍵點 13安全管理 13基于高通量測序的核酸檢測程序 14工作流程 14設(shè)施設(shè)備與環(huán)境 15質(zhì)量控制關(guān)鍵點 16安全管理 19附錄A（資料性附錄）實驗室功能區(qū)核酸檢測采樣方案 20發(fā)布日期：2022發(fā)布日期：20220301日醫(yī)學實驗室 核酸檢測質(zhì)量和安全指南范圍本指南適用于醫(yī)學實驗室從事核酸檢測時參考使用。規(guī)范性引用文件（部分）適用于本指南?！夺t(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》GB19489《實驗室生物安全通用要求》GB19781《醫(yī)學實驗室安全要求》GB4793.9《測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全要求》GB/T22576.1《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求》YY0569《Ⅱ級生物安全柜》WS233《病原微生物實驗室生物安全通用準則》WS589《病原微生物實驗室生物安全標識》WS/T640《臨床微生物學檢驗標本的采集和轉(zhuǎn)運》WS/T648《空氣消毒機通用衛(wèi)生要求》ISO15190《醫(yī)學實驗室安全要求》ISO22367《醫(yī)學實驗室-風險管理在醫(yī)學實驗室的應用》ISO/TS20658《醫(yī)學實驗室-樣品采集、運送、接收和處理指南》CNAS-CL02-A001：2021《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則的應用要求》CNAS-GL039：2019《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》總則應滿足相關(guān)的標準和法規(guī)要求。WS/T640ISO/TS《醫(yī)學實驗室-第PAGE第10頁共22頁發(fā)布日期：2022發(fā)布日期：20220301日等標準要求。核酸檢測和解釋應依據(jù)相關(guān)的標準要求。安全警示標識滿足WS589《病原微生物實驗室生物安全標識》要求。ISOWSGB以及相關(guān)法律法規(guī)和主管部門的要求。基于擴增的核酸檢測程序手工核酸提取純化及檢測方法工作流程核酸檢測過程分為檢驗前、檢驗中和檢驗后（具體內(nèi)容見表1采集、轉(zhuǎn)運和接收、核酸提取、PCR檢測過程內(nèi)容檢驗前過程檢測項目的申請，知情同意的簽署，樣本的采集、運輸檢測過程內(nèi)容檢驗前過程檢測項目的申請，知情同意的簽署，樣本的采集、運輸接收和保存、耗材的驗收等檢驗中過程等檢驗后過程和材料的保存、處理及銷毀等、送檢申請、樣本采集、樣本運輸、樣本接收等檢驗前過程應符合GB/T22576.1-20185.4要求；PCR擴增等檢驗中過程應符合GB/T22576.15.55.6要求；報告的解釋及發(fā)放，數(shù)據(jù)的處理及保存等檢驗后過程應符合GB/T22576.15.7、5.8、5.9要求。設(shè)施設(shè)備與環(huán)境設(shè)施設(shè)備檢測設(shè)備安全設(shè)施設(shè)備高壓滅菌器、紫外線消毒燈和空氣消毒機等。生物安全柜YY0569《Ⅱ級生物安全柜》的要求。員進行。樣本滅活設(shè)備校準。已使用化學劑可靠滅活的樣本無需進行熱滅活處理。高壓滅菌器紫外線消毒燈可使用移動紫外消毒裝置。空氣消毒機WS/T648環(huán)境要求實驗室（包括移動或方艙型實驗室）應符合相應防護級別的生物安全實驗室的設(shè)計和建造要求，應滿足檢測質(zhì)量的要求并保證人員以及周圍環(huán)境的安全。a）保障檢測質(zhì)量的要求明書要求進行設(shè)置，并監(jiān)測和記錄相關(guān)的環(huán)境參數(shù)；b）保障人員和環(huán)境安全的要求GBWS原微生物實驗室生物安全通用準則》以及ISO15190的要求。設(shè)施設(shè)備和環(huán)境檢查內(nèi)容：檢計劃，檢查并記錄；設(shè)施設(shè)備的日常使用應明確使用風險、資質(zhì)和防護要求；應定期采集實驗室環(huán)境樣本檢測環(huán)境污染情況，如采集桌面、移液器、（8小時（重復采樣合分析，如存在污染風險應按照實驗室去污染流程進行清潔后重新采樣評估。質(zhì)量控制關(guān)鍵點性能驗證行性能驗證。測量和/或可報告范圍，抗干擾能力等。定性檢測方法：驗證內(nèi)容至少應包括測定下限、特異性、準確度（學比較或與金標準比較、抗干擾能力等。檢驗前質(zhì)量控制WS/T640《臨床微生物學檢驗標本的ISO/TS20658《醫(yī)學實驗室-樣品采集、運送、接收和處理指南》（毒《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)2019南要求。試劑盒說明書要求，不應含有已知干擾檢測的組分。檢測中質(zhì)量控制足要求。核酸提取效率評價可包括：核酸濃度、純度及完整性。1個弱陽性質(zhì)控和/3組分應不包含干擾檢測的成分。置陽性質(zhì)控物。檢測后質(zhì)量控制Ct不符合的，應進行分析并采取糾正預防措施。含有內(nèi)標的檢測系統(tǒng)，內(nèi)標檢測情況應符合檢測試劑盒說明書要求。對于內(nèi)標檢測情況不符合要求的樣本，可進行個別樣本復查。安全管理GB19781GB19489《實驗ISO《醫(yī)學實驗室-等標準，以及相應法規(guī)的要求。人、物、操作、環(huán)境管理和生物安全及安保的管理要求和措施。實驗人員部門規(guī)章和標準，有相關(guān)的工作經(jīng)歷。主要包括以下環(huán)節(jié)：合評估，其中對工作人員的能力和安全意識的評估至關(guān)重要；人員培訓。做好實驗人員的崗前培訓、在崗持續(xù)培訓以及定期或不定期的操作習慣；包括對培訓效果和心理健康進行評估，評估合格后才能從事實驗工作。應禁止非授權(quán)人員進入實驗室，對病原等危險因子應有安防措施。樣品和實驗材料（（的使用等普通樣本因子的種類（已知的、未知的生物材料、樣本的來源、致病性、傳染性、可疑的傳播途徑、在環(huán)境中的穩(wěn)定性、感染劑量等。誤用、被盜。菌毒種在檢查包裝完好后，按照要求進行保存并做好清晰標識。實驗材料定人員被試劑污染的應急措施。操作3a）吸入感染性氣溶膠；1）實驗操作中開啟存有凍干菌毒株的安瓿瓶；用移液器抽吸菌毒液或細菌病毒的培養(yǎng)液；注射器針頭或移液器槍頭在使用中脫落，噴出感染性液體；在進行轉(zhuǎn)移采集的體液、血液等液體樣品時；b）經(jīng)口食入；在實驗活動區(qū)域內(nèi)飲食，被污染的食品經(jīng)口進入體內(nèi)。c）皮膚、粘膜感染；因溢灑或噴濺而將病毒培養(yǎng)液或細菌培養(yǎng)液與破損的皮膚、粘膜接觸。環(huán)境管理生物安全實驗室有普通型和加強型（WS233）區(qū)分，應在日常巡檢、例行檢查、定期維保中予以關(guān)注。隨意處理實驗室廢棄物。生物安保（但不限于下內(nèi)容：或組織等；風險材料的丟失；風險材料被誤用、盜用；風險材料在實驗室內(nèi)被未經(jīng)授權(quán)的使用；風險材料被人為故意泄露或意外泄露；全自動核酸提取純化及檢測方法工作流程PCR4.1部分相應內(nèi)容。設(shè)施設(shè)備與環(huán)境設(shè)施設(shè)備PCR環(huán)境要求保障檢測質(zhì)量的要求放置區(qū)域：全自動核酸提取純化設(shè)備應放置在核酸擴增檢驗實驗室的樣本制備區(qū)，PCR室應符合生物安全二級（BSL-2）實驗室標準；PCR儀設(shè)備工作條件：環(huán)境溫濕度應符合設(shè)備要求；實驗室承重及實驗臺承重GB4793.9有功率冗余。4.1部分相應內(nèi)容。質(zhì)量控制關(guān)鍵點校準及移動（如包括（如包括（如包括（如包括內(nèi)容及校準的時間間隔，文件要求應符合設(shè)備供應商說明及相關(guān)標準規(guī)定等。性能驗證：CNAS-GL039：2019驗證外，還應考慮，5備提取純化核酸后進行檢測。陰性樣本應不出現(xiàn)陽性結(jié)果。息傳輸功能前，應進行信息傳輸驗證。程結(jié)果比對，間接進行核酸提取純化方法學之間的比對。檢測前質(zhì)量控制樣本的采集應參考相關(guān)臨床標準進行。檢測中質(zhì)量控制括添加樣本在內(nèi)的核酸提取純化操作。檢測后質(zhì)量控制見4.1.3.4部分相應內(nèi)容。安全管理參見4.1相應部分內(nèi)容。本噴濺造成污染風險。（涉及新型冠狀病毒等高致病性病原微生物樣本時，應采用生物安全三級實驗室個人防護。PCR分析系統(tǒng)工作流程PCRPCR擴增、數(shù)據(jù)分析等一系列流程/分析數(shù)據(jù)并可通過網(wǎng)關(guān)將數(shù)據(jù)系統(tǒng)，以實現(xiàn)全程無人工參與的全流程自動化。設(shè)施設(shè)備與環(huán)境設(shè)施設(shè)備一體的檢測設(shè)備可包含不同分工模塊，例如：a）樣本供應模塊：樣本的輸入與輸出；b）處理模塊：樣本純化，包括裂解、清洗、洗脫；PCR增板中完成試劑、樣本的混合，并封膜；分析模塊：擴增反應及檢測；庫存管理單元：存儲試劑、質(zhì)控品、裂解液、洗脫液、磁珠、洗液等；存儲槍頭、深孔板及擴增板等。環(huán)境要求PCR相應部分內(nèi)容。質(zhì)量控制關(guān)鍵點PCR下，用以保障發(fā)出的報告的準確性。4.2.3（質(zhì)量控制關(guān)鍵點）內(nèi)容外，還應考慮：a）SOPb）試劑、耗材管理：必須按照廠家要求進行試劑、耗材的存儲和有效期的管理。安全管理參見4.1相應部分內(nèi)容。全自動核酸檢測一體設(shè)備應設(shè)置化學消毒或紫外消毒模塊。基于高通量測序的核酸檢測程序工作流程高通量測序核酸檢測流程如下：送檢申請樣本采集樣本運輸樣本接收送檢申請樣本采集樣本運輸樣本接收文庫定量和混合文庫構(gòu)建核酸提取樣本前處理文庫定量和混合文庫構(gòu)建核酸提取樣本前處理測序信息分析結(jié)果解讀報告發(fā)放測序信息分析結(jié)果解讀報告發(fā)放圖1高通量測序核酸檢測流程圖GB/T22576.15.4～5.9求，高通量測序的核酸檢測工作流程中還需注意以下幾點：（如適用5’DNA每個環(huán)節(jié)根據(jù)檢測項目的特性進行純化去除雜質(zhì)；DNA的文庫進行混合；式、SAM格式、BED格式、VCF格式等；（如適用告解讀的途徑以供受檢者咨詢。設(shè)施設(shè)備與環(huán)境設(shè)施設(shè)備檢測設(shè)備織細胞勻漿儀、溫浴儀等；光度計等；文庫定量和混合：文庫濃度檢測設(shè)備通常有生物分析儀、qPCR站替代手工操作；測序：基因測序儀、測序儀配套或輔助設(shè)備等；力蒸汽滅菌器、紫外線消毒燈和空間滅菌器等。環(huán)境要求DNA器大小設(shè)置單獨的機房區(qū)域，用于存放服務器。保障檢測質(zhì)量的環(huán)境要求備，測序區(qū)應采取減震措施減少測序儀周圍環(huán)境中震動的發(fā)生；次的空白質(zhì)控（超純水。如果空白質(zhì)控不合格應調(diào)查不合格原因并采取糾正和不合格應按照實驗室清潔流程進行清潔后重新采樣評估；1Gbit/sCPU、內(nèi)存和磁盤存儲的要求。保障人員和環(huán)境安全的要求高通量測序?qū)嶒炇腋鲄^(qū)空調(diào)相互獨立，不可連通。對于有負壓要求的實裝由室內(nèi)向室外排出空氣的排風扇；實驗室應配置洗眼器和緊急噴淋，用于緊急情況的應急處理；行時應確保芯片倉門已關(guān)閉；測序儀產(chǎn)生的廢液使用廢液桶收集，廢液中的化學成分對眼睛、皮膚和處理；型消防裝備對測序儀等精密貴重儀器造成損害。質(zhì)量控制關(guān)鍵點性能驗證檢驗前質(zhì)量控制臨床咨詢等。檢測項目申請單及知情同意的填寫寫檢測項目申請單，臨床醫(yī)師指導受檢者充分了解并簽署知情同意書。樣本采集采樣類型和采樣量的要求DNA流調(diào)信息和病例傳播鏈關(guān)系，確定優(yōu)先采集的病例。樣本采集、運輸、接收與保存要求4.1.3.2的相關(guān)內(nèi)容。檢驗中質(zhì)量控制核酸提取核酸純度及核酸的片段分布來評價核酸提取的質(zhì)量。文庫構(gòu)建布也會不同。文庫定量和混合高通量測序核酸檢測項目可通過加入與文庫基質(zhì)相同或相似的質(zhì)控樣品評（如Westgard質(zhì)控規(guī)則）來監(jiān)控文庫定量準確性。室應制定混合后文庫濃度的合格標準。測序Q20Q30totalreadstotalbases等指標。信息分析reads質(zhì)量、GC含量、比對率、reads比對質(zhì)量、最低測序深度、最小突變頻率、鏈偏倚等。生信結(jié)果解讀陽性率發(fā)生顯著波動時，需及時排查原因并采取糾正預防措施。設(shè)備管理（UI啟動檢查（（塊（密封圈、負壓、注射器、芯片過液等、冰箱溫度、試劑針等進行檢查，在的檢查和性能測試。人員管理能從事臨床基因擴增檢驗工作。室內(nèi)質(zhì)量控制與室間質(zhì)評置陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、空白質(zhì)控品，以監(jiān)控檢測過程質(zhì)量。中心組織的能力驗證或室間質(zhì)評計劃。檢驗后質(zhì)量控制檢驗后環(huán)節(jié)主要包括報告的解釋及發(fā)放，數(shù)據(jù)及報告的保存及樣本的保存。報告在發(fā)放前應由具備相關(guān)專業(yè)技術(shù)職稱的授權(quán)人員核對無誤后方可簽發(fā)。限應進行分級控制。實驗室應建立高通量測序數(shù)據(jù)保存類型和保存期限相關(guān)要求，一般保存文件、BAM文件和VCF文件，并保留雙備份。數(shù)據(jù)保存應符合CNAS-CL02-A001:2021《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則的應用要求》4.13記錄控制。高通量測序數(shù)據(jù)涉及受檢者隱私，未經(jīng)授權(quán)不得公開。進行保存。超過保存期限的樣本，按照醫(yī)療廢物進行處理。安全管理參見4.1相應部分內(nèi)容。附錄A（資料性附錄）實驗室功能區(qū)核酸檢測采樣方案采樣方法物體表面取樣時用蘸取滅菌的生理鹽水/PBS內(nèi)畫交叉線（如圖A.1，盡量讓植絨拭子每個面都接觸到采樣目標，一個采樣采樣信息。A.1采樣區(qū)域內(nèi)交叉線采樣法采樣區(qū)域及編號A.113個植絨拭子。A.1采樣區(qū)域采樣編號采樣點及要求樣品處理室管1把手、傳遞窗、臺面管2組織研磨儀、離心機、生物安全柜管3留樣冰箱、臨時存放樣品冰箱管4氣溶膠【外部環(huán)境】、氣溶膠【生物安全柜內(nèi)】管5移液器血清檢測室管6地面、把手、臺面、移液器管7恒溫培養(yǎng)箱、振蕩器、洗板機、酶標儀內(nèi)部、生物安全柜體系配置室管8把手、儀器、臺面、離心機管9氣溶膠【外部環(huán)境】、氣溶膠【生物安全柜內(nèi)】管10移液器、超凈工作臺/生物安全柜核酸提取室管11把手、臺面、離心機、核酸提取儀管12氣溶膠【