從MISEV2023中尋找外泌體標(biāo)志物 WB陰性的解決方案

從MISEV2023中尋找外泌體標(biāo)志物WB陰性的解決方案作者：綠野目前，細(xì)胞外囊泡（EVs）的發(fā)展如火如荼，EVs的命名、分離、表征、功能研究和臨床轉(zhuǎn)化等方面仍存在諸多挑戰(zhàn)。為應(yīng)對(duì)這一快速發(fā)展領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和機(jī)遇，國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)(ISEV)發(fā)布了最新版的MISEV。MISEV2023匯編了來自ISEV專家工作組和1000多名研究人員的反饋，為研究人員提供了最新的研究方法和指導(dǎo)原則，推動(dòng)該領(lǐng)域更快地向前發(fā)展。眾所周知，無論哪種外泌體分離方法都很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，因此需要對(duì)收集的外泌體樣本進(jìn)行鑒定。常見鑒定方法，除了電鏡鑒定形態(tài)、粒徑分析技術(shù)檢測(cè)粒徑分布和濃度之外，還要結(jié)合WesternBlot等技術(shù)進(jìn)行外泌體標(biāo)志物蛋白檢測(cè)。本文我們?cè)噲D對(duì)國人外泌體研究中遇到的最基礎(chǔ)也是最麻煩的問題：利用Westernblot（WB）鑒定外泌體標(biāo)志物經(jīng)常獲得陰性結(jié)果的問題在MISEV2023中尋找答案，并總結(jié)一些解決方案。MISEV2023正文中指出：目前，沒有通用標(biāo)志物可以識(shí)別所有EV。雖然之前已經(jīng)提出了幾種蛋白質(zhì)作為EV生物發(fā)生途徑的假定標(biāo)志物（例如AnnexinA1、SLC3A2、BSG和Lamp1等），但這些標(biāo)志物的普遍性尚不清楚或未被接受。需要注意的是，涉及四跨蛋白CD9、CD63和CD81的基于親和力的富集方案對(duì)于外泌體而言不是特異性的，并不是所有的EV都會(huì)顯示這些蛋白。圖1MISEV2023對(duì)外泌體標(biāo)志物的描述MISEV2023建議繼續(xù)使用MISEV2018中的五大類標(biāo)志物蛋白進(jìn)行EV表征。第1類和第2類蛋白用于評(píng)估EV的存在，第3類蛋白主要用來進(jìn)行EV純度評(píng)估，第4類和第5類蛋白可提供EV細(xì)胞內(nèi)起源或共分離物的額外信息，建議選擇前3類蛋白中每個(gè)類別至少一種蛋白作為EV標(biāo)志物。表1基于蛋白質(zhì)的EV表征MISEV2023的內(nèi)容或可一定程度上解釋為什么WesternBlot實(shí)驗(yàn)有些時(shí)候無法檢出外泌體蛋白標(biāo)志物。總體而言，綜合文獻(xiàn)和項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，小編認(rèn)為可匯總為以下幾點(diǎn)：檢測(cè)指標(biāo)。外泌體表面沒有表達(dá)/顯示CD9、CD63、CD81等標(biāo)志物蛋白，常用的標(biāo)志物指標(biāo)不具備通用性。EV異質(zhì)性。該特性在體液樣本中尤為突出，其收集的EV有明顯異質(zhì)性特點(diǎn)（來源異質(zhì)性、尺寸異質(zhì)性、攜帶內(nèi)容物異質(zhì)性和功能異質(zhì)性），不同的EV表面標(biāo)志物表達(dá)各不相同。EV純度。不同EV提取方法各有利弊，例如分別使用密度梯度離心和PEG沉淀法從相同樣本中收集EV，前者純度更高。在等蛋白量上樣進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，密度梯度離心法制備的EV樣本可能有效的EV蛋白量更多，更容易出現(xiàn)標(biāo)志物陽性檢出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程。以經(jīng)典WesternBlot為例，一些實(shí)驗(yàn)耗材（如抗體）及實(shí)驗(yàn)參數(shù)等都有可能影響最后檢測(cè)結(jié)果，建議添加陽性樣本以排除由于實(shí)驗(yàn)過程失誤導(dǎo)致的陰性結(jié)果。檢測(cè)技術(shù)。常見EV表面標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)有：WesternBlot、納米流式、免疫膠體金、ELISA等，不同技術(shù)的檢測(cè)原理、靈敏度、準(zhǔn)確性等各有不同，可能會(huì)影響結(jié)果呈現(xiàn)。目前，對(duì)于EV蛋白標(biāo)志物檢測(cè)部分，大部分文章中呈現(xiàn)的還是WesternBlot數(shù)據(jù)，其實(shí)納米流式不僅可以用于EV粒子濃度和粒徑分布檢測(cè)，其用于EV標(biāo)志物檢測(cè)也不失為一種好的補(bǔ)充方案。早在2019年，一篇發(fā)表在國際外泌體頂級(jí)期刊JournalofExtracellularVesicles上的文章已經(jīng)通過納米流式等技術(shù)分析了六種EV分離方法的質(zhì)量和效率（TianY,etal.,2019），納米流式分析結(jié)果直接且有結(jié)論性。圖2EV標(biāo)志物檢測(cè)而且有很多文獻(xiàn)在外泌體蛋白標(biāo)志物（如CD9、CD63和CD81）的鑒定環(huán)節(jié)僅用納米流式技術(shù)，不再使用WB（ZhanX,etal.,2022；LinZ,etal.,2023；LiaoM,etal.,2024）。圖3文章中基于納米流式的EV標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果此外，還有很多文獻(xiàn)同時(shí)應(yīng)用了WesternBlot和納米流式兩種技術(shù)對(duì)外泌體標(biāo)志物蛋白進(jìn)行檢測(cè)（YangL,etal.,2022；ChenJ,etal.,2022；GuZ,etal.,2022；ShengB,etal.,2023；WilliamsS,etal.,2023）。大部分文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示納米流式和經(jīng)典WesternBlot結(jié)果具有一致性。圖4文獻(xiàn)中同時(shí)基于WesternBlot和納米流式的EV標(biāo)志物檢測(cè)數(shù)據(jù)同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)有意思的現(xiàn)象：納米流式總會(huì)有陽性結(jié)果，其原因大致因?yàn)榧{米流式是對(duì)單個(gè)外泌體進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，不像WesternBlot一樣會(huì)受到雜蛋白的影響而降低上樣孔中有效EV蛋白量的占比，因此更容易出現(xiàn)陽性結(jié)果。納米流式的結(jié)果顯示出的外泌體的經(jīng)典蛋白標(biāo)志物在實(shí)測(cè)樣本中的占比并不高，大部分在10%以下，這就解釋了為什么研究人員通過WesternBlot實(shí)驗(yàn)經(jīng)常不能獲得陽性結(jié)果的原因，也解釋了為什么MISEV2023作為外泌體研究指南要增加相關(guān)內(nèi)容的描述。最后，對(duì)于外泌體標(biāo)志物WesternBlot檢測(cè)結(jié)果不理想的情況，華盈生物給出以下參考解決方案：1、提取方法的優(yōu)化。如果條件允許，可采用純度更高的外泌體提取方案，降低外泌體提取階段引入的雜蛋白等污染，從而將樣本問題對(duì)后續(xù)WesternBlot結(jié)果的負(fù)面影響最小化。2、WesternBlot實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。首先，添加陽性樣本以排除由于實(shí)驗(yàn)過程失誤導(dǎo)致的陰性結(jié)果，保證最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行上樣量增加等步驟優(yōu)化。其次，由于CD9、CD63、CD81等標(biāo)志物蛋白可能不具備通用性，可以嘗試增加或改變標(biāo)志物靶標(biāo)以獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后，如果陽性條帶很淺可通過延長曝光時(shí)間或增加上樣量獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）更換檢測(cè)方案，如納米流式。納米流式用于EV粒子檢測(cè)和標(biāo)志物檢測(cè)，結(jié)果直接且有結(jié)論性，可作為獨(dú)立的鑒定方法被文獻(xiàn)采用。華盈生物——打造血液標(biāo)志物研究系統(tǒng)性方案1）“蛋白芯片”和“蛋白質(zhì)譜”雙平臺(tái)技術(shù)服務(wù)體系，完美助力血液蛋白標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，雙管齊下，減少血液低豐度蛋白的漏篩，發(fā)現(xiàn)最具臨床意義的標(biāo)志物。2）“外泌體研究體系”實(shí)現(xiàn)了外泌體“分離—鑒定—標(biāo)志物篩選—驗(yàn)證—建模”一站式服務(wù)體系，可全面篩選血液外泌體中的RNA、蛋白、脂類等，在房水、齦溝液等超微量樣本外泌體、菌群外泌體及單外泌體蛋白組檢測(cè)方面更具特色和優(yōu)勢(shì)。3）“20k人類蛋白組芯片”包含大約2萬多種人類全長蛋白質(zhì)，可全面篩選血液自身抗體，發(fā)現(xiàn)腫瘤、自身免疫疾病等新的自身抗體診斷標(biāo)志物。4）“CyTOF質(zhì)譜流式”可支持全血樣本、組織樣本、單細(xì)胞懸液等多種樣本類型的分析，抗體庫包含常用的人源抗體500多種，鼠源抗體300多種，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各類細(xì)胞亞型、細(xì)胞功能的精準(zhǔn)分析。5）“空間單細(xì)胞蛋白組”在空間維度上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分析，通過細(xì)胞的空間分布和細(xì)胞間的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與病理發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)的細(xì)胞亞群標(biāo)志物。6）“ISOP單細(xì)胞功能蛋白組”可對(duì)單個(gè)細(xì)胞分泌的32種功能蛋白進(jìn)行逐一檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)同類細(xì)胞中處于不同功能狀態(tài)的細(xì)胞亞類，作為抗體藥治療和CAR-T/NK細(xì)胞治療等腫瘤治療的伴隨診斷標(biāo)志物。多年來華盈生物服務(wù)客戶已經(jīng)覆蓋國內(nèi)各大著名的高校院所和多位院士課題組。華盈的專業(yè)和專注也已獲得業(yè)界普遍認(rèn)可，合作者的科研成果也先后在CancerCell、PNAS、JClinInvest、NatCommun、JHepatol、SciTranslMed、Circulation等著名期刊上發(fā)表。業(yè)務(wù)咨詢400-869-2936微信同號(hào)）相關(guān)文獻(xiàn)WelshJA,etal.Minimalinformationforstudiesofextracellularvesicles(MISEV2023):Frombasictoadvancedapproaches.JExtracellVesicles.2024.TianY,etal.Qualityandefficiencyassessmentofsixextracellularvesicleisolationmethodsbynano-flowcytometry.JExtracellVesicles.2019.LinZ,etal.CirculatingMiRNA-21-enrichedextracellularvesiclespromoteboneremodelingintraumaticbraininjurypatients.ExpMolMed.2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