微生物降解香菇栽培料中的棉酚

姓名：包劉媛學號：20111052112微生物降解香菇栽培袋料中的棉酚研究可行性分析課題背景、意義、思路材料與方法參考文獻目錄一、課題背景、意義、思路1、背景：①香菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美，并具有藥用價值。分布廣，尤其是云南地區(qū)。大量種植香菇給千家萬戶帶來了豐厚的回報。香菇的栽培方式主要有段木栽培、袋料栽培兩種，而袋料栽培是最為通用的。但是香菇在收獲之后剩下了大量的栽培袋料，雖然香菇栽培袋料中含有大量的蛋白質，粗脂肪，纖維素等營養(yǎng)成分，是一種非常好的資源，但是由于使用棉籽殼作為其主要原料，它含有一定量的有毒物質-棉酚，會對動物生產、發(fā)育和繁殖等產生不良的影響，因此不能將其再使用，成為一種廢棄物和污染源，造成巨大的浪費。②國家在飼料衛(wèi)生標準中規(guī)定肉用仔雞，生長雞配合飼料中的游離棉酚的允許量不得大于100mg／kg，肉用仔豬，生長肥育豬配合飼料中的游離棉酚的允許量不得大于60mg/kg．歐盟對單胃動物日糧中游離棉酚允許量的規(guī)定與中國標準一樣，除此之外還規(guī)定了反芻動物日糧中游離棉酚允許量，其成年牛，山羊，綿羊≤500mg／kg，犢?！?00mg／kg，其他不含棉籽餅粕飼料和配合飼料≤20mg／kg．因此如果將香菇栽培袋料作為飼料再利用，必須除去栽培袋料中的棉酚，既可作為飼料在利用。③傳統(tǒng)棉酚脫毒主要可分為物理脫毒法，化學處理法等．然而物理脫毒法脫毒率低，化學法會造成溶劑殘留等缺點，因此近幾年新興的棉酚脫毒方法主要是微生物發(fā)酵法脫毒．2、意義：本課題嘗試從飼料允許添加的微生物菌種中，篩選出最優(yōu)的菌種和發(fā)酵方式，通過發(fā)酵過程條件優(yōu)化，獲得符合國家標準的新飼料源，并提高其營養(yǎng)價值和利用率．3、思路：①、由于棉籽餅發(fā)酵脫毒常用的菌株為黑曲霉，乳酸菌，釀酒酵母，而本研究主要目的是對香菇栽培袋料中的棉籽殼進行脫毒，所以選用以上三種菌種進行單菌發(fā)酵及復合發(fā)酵處理。②、由于溫度、含水量、接種量因素的影響，所以要設置不同的條件進行試驗。③、若由上兩點組合控制變量試驗，工作量太大，可以先設定一個常規(guī)條件用上述三種菌種進行單菌發(fā)酵及復合發(fā)酵處理，看其脫毒效果。若效果明顯再進行控制變量單因子優(yōu)化試驗。二、材料與方法1、材料①樣品：香菇栽培料（由楚雄種植香菇處提供，樣品均粉碎后備用。）②設備：培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，超聲波儀，離心機，真空抽濾儀，研磨機，冰箱等．③儀器：陶瓷盤，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，試管等。⑤試劑：棉酚標準品(含99％純棉酚)，濃鹽酸，丙酮，間苯三酚，95％乙醇等。⑥菌種：干酪乳桿菌(LacticacidbacteriaT7)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)C（對照組）R:干酪乳桿菌組J:釀酒酵母組H:黑曲霉組R+J（1:1）R+H（1:1）H+J（1:1）H+J+R（1:1:1)條件：溫度37℃，接種量10%，含水量50%，20g/組香菇栽培袋料①微生物固體發(fā)酵：將栽培袋料和菌種攪拌均勻后，蓋上6層潤濕紗布防止灰塵，放人恒溫培養(yǎng)箱中37℃發(fā)酵48h，結束后60℃烘干，48h后存放于干燥器中待測。2、方法②、游離棉酚測定方法：A、棉酚標準溶液的制備．準確稱取0.005g棉酚標準品，用70％丙酮溶液溶解，并用50mL容量瓶定容，溶液棉酚濃度100μg/mL．B、顯色劑的配置：用100mL量筒量取16.6mL濃鹽酸(12.0mol/L)，加入95％的乙醇至100mL刻度，倒入100mL三角瓶中，搖勻，再加入1g間苯三酚，溶解后混合置于三角瓶中放入冰箱中備用(顯色劑顏色變黃時不能使用，現(xiàn)配現(xiàn)用)．

C、標準曲線的繪制．準確吸取100μg/mL棉酚標準溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL加入10mL試管內，編號1-6號,再依次加入70％丙酮溶液1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0mL，各試管中再加入2mL顯色劑，搖勻，在55℃恒溫水浴箱中加熱5min．用70％丙酮溶液調零，在550nm波長處測定吸光值并繪制標準曲線，得其回歸方程。

D、樣品棉酚含量的測定．準確稱取樣品1.0g于具塞錐形瓶中，首先加入約15mL丙酮溶液，蓋上瓶塞，超聲15min，9000rpm條件下離心，將上清液回收于100毫升試管中靜置，重復以上步驟兩次，用中速濾紙將回收的上清液過濾于50mL容量瓶中，丙酮溶液洗滌并定容．移取濾液1mL于試管中，各加入2mL顯色劑，搖勻，測定550nm處吸光值，計算濾液棉酚含量．

E、樣品棉酚含量計算．計算公式：Y=（X*Z）/(n*m)式中，y為樣品中游離棉酚的含量(mg/kg)；X為測定用樣液中游離棉酚的含量(μg/mL)；Z為樣品提取液體積(mL)；力為稱取的樣品質量(g)；m為吸取濾液體積(mL)．脫毒率的計算：脫毒率(％)=1一樣品棉酚含量/對照棉酚含量

③單因子優(yōu)化：

稱量20g粉碎過篩的香菇栽培袋料至陶瓷盤中，選取合適的發(fā)酵菌種，進行含水量，溫度，接種量三個因素的單因素優(yōu)化試驗．接種量：按照5％，10％，15％，20％，25％的接種量接人處理過的香菇栽培袋料中，含水量50％，37℃發(fā)酵48h，發(fā)酵結束后烘干48h測定棉酚含量．

含水量：按照50％，55％，60％，65％，70％的含水量，固定接種量和溫度發(fā)酵48h，發(fā)酵結束后烘干48h測定棉酚含量．溫度：按照30℃，35℃，40℃，45℃，50℃的培養(yǎng)溫度，固定接種量和含水量發(fā)酵48h，發(fā)酵結束后烘干48h測定棉酚含量．

同時每一組設置三個重復減小誤差④數(shù)據(jù)分析：用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。三、可行性分析1、取材：取材方便。

①、香菇栽培料，由楚雄種植香菇處提供，11、12月份真是采收時期，有大量的廢棄栽培料；②、試劑：酚標準品(含99％純棉酚)，耗材不多，可支付范圍內；濃鹽酸，丙酮間苯三酚，95％乙醇，實驗室都有。③、菌種：干酪乳桿菌(LacticacidbacteriaT7)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)實驗室也有；2、設備：

培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，超聲波儀，離心機，真空抽濾儀，研磨機冰箱等微生物實驗室都有。3、儀器：陶瓷盤，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，試管等都是實驗室常用儀器。4、操作：

簡單方便，都是常規(guī)操作；5、耗時：

一組實驗大約要50h，其中發(fā)酵培養(yǎng)要48h，干燥48h.而標準曲線的制定需要6h，初步可行的話，加上后面的優(yōu)化實驗50h，后期數(shù)據(jù)分析大概一星期，準備工作一星期，若遇問題處理時間三星期SO~~~保守估計：一之三個月。當然這只是估計時間。四、參考文獻[1]春芳，李全豐，王彩玲．生料固態(tài)發(fā)酵法降鰓棉酚的工藝研究[J]．中國飼料，2011，3：41．[2]王利，汪開毓．動物棉酚中毒的研究進展[J]．飼料與添加劑，2002.5：26-28．[3]閻軼潔，宋維平，等．棉籽餅粕在畜禽中的應用及棉酚的脫毒方法研究[J]飼料工業(yè)，2005,26(3)：47—50．[4]石秀俠，程茂基，蔡克周，等．棉籽餅有毒物質及其脫毒方法研究進展[J]．飼料博覽，2005,(6)：8—10．[5]王紅云，高占峰，付才．棉籽餅粕脫毒方法研究進展[J]．河北農業(yè)科學,2004,8(1)：67—68．[6]喬國平，王立，王興國．棉籽餅粕脫毒方法研究進展[J]．糧食與油脂，2002,(3)：27—29．[7]朱德偉，劉志鵬，蔡國林．高效降解棉酚菌種的篩選及棉粕發(fā)酵脫毒工藝研[J]．中國油脂，2010，35(2)：24．[8]文舉．高效降解棉酚菌種的選育及棉粕生物發(fā)酵的研究[D]．杭州：浙江大學,2006．[9]顧賽紅，孫建義，李衛(wèi)芬．黑曲霉PES固體發(fā)酵對棉籽粕營養(yǎng)價值的影響[J]．中國糧油學報，2003，18(1)：70．[10]楊繼良，周大云，楊偉華，等．高效降解棉酚菌種的篩選及棉籽餅脫毒參數(shù)的研究[J]．棉花學報，2000，12(5)：225．[11]張文舉，許梓榮，孫建義，等．假絲酵母zD3與黑曲霉Zn8復合固體發(fā)酵對棉籽餅脫毒及營養(yǎng)價值的影響研究[J]．中國糧油學報，2006，21(6)：129．[12]趙順紅．棉粕生物發(fā)酵脫毒效果[D]．新疆石河子：石河子大學。2007：31．[13]全鑫，周春雨，范婕妤．草甘麟高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J]．四川大學學報：自然科學版，20lO，47(4)：921．[14]吳嬡瑾，王承明，吳謀成．響應面優(yōu)化棉籽餅粕中棉酚的提取條件[J]．棉花學報，2009，21(2)：94．[15]李真金，任丹，蘇文濤．L-乳酸高產菌選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．四川大學學報：自然科學版，2011，48(2)：451．[16]李濤，岳田利，袁亞宏．蘋果多酚提取的響應曲面