廣西梨地方品種的遺傳多樣性研究

廣西梨地方品種的遺傳多樣性研究齊丹現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-29-01)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程，曹玉芬1*，胡紅菊2，王超1，常耀軍1，田路明1，董星光1，張瑩1，霍宏亮1，徐家玉1，劉超現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-29-01)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程1中國農業(yè)科學院果樹研究所，農業(yè)部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城125100；2湖北省農業(yè)科學院果樹茶葉研究所，武漢430064*通訊作者，E-mail:yfcaas@263.net摘要為評價廣西梨地方品種的遺傳多樣性水平，對54份廣西梨地方品種的葉綠體DNA高變區(qū)域accD-psaI進行測序。經比對后序列長度為683-936bp不等，檢測出單倍型數量為6個，1個簡約性信息位點，5個單一突變位點，5個插入/缺失InDels片段，單倍型多樣性Hd為0.710，核苷酸多樣性Pi為0.64×10-3。單倍型H1、H2和H3為常見單倍型，其中H1在廣西各地分布最為廣泛。Median-joiningNetwork圖顯示，單倍型H4和H5為原始單倍型，單倍型H2，H3，H8為較進化單倍型。2個原始單倍型均在橫縣地區(qū)的梨地方品種中檢測到，同時橫縣地區(qū)的單倍型類型最多，推測橫縣地區(qū)為廣西梨起源與多樣性中心。關鍵詞梨；地方品種；葉綠體DNA；遺傳多樣性AnalysisofgeneticdiversityofpearlandracesinGuangxiZhuangAutonomousRegionQIDan1,CAOYufen1*,HUHongju2,WANGChao1,ChangYaojun1,TIANLuming1,DONGXingguang1,ZHANGYing1,HUOHongliang1,XUJiayu1,LIUChao1,ZHANJunyu11ResearchInstituteofPomology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops;GermplasmResourcesUtilization,Xingcheng,Liaoning125100,China;2InstituteofFruitandTea，HubeiAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan430064，China*Correspondingauthor,E-mail:yfcaas@263.netAbstract：Toinvestigatethegeneticdiversityleveloflocalvarieties,thehypervariableregionaccD-psaIofchloroplastDNAin54localvarietiesoriginatedinGuangxiZhuangAutonomousRegionweresequenced.Thelengthof54sequenceswerevariedfrom683to936afteraligning,andthenumberofhaplotypeswas6,thehaplotypediversityHdwas0.710,andthenucleotidediversityPiwas0.64×10-3.1parsimonyinformativesites,5singlemutationsites,5insert/deletion(InDels)fragments.HaplotypesH1,H2andH3werecommonhaplotypes,ofwhichH1wasmostwidelydistributedthroughoutGuangxi.TheMedian-joiningNetworkpictureshowedthathaplotypesH4andH5wereprimitivehaplotypes,andhaplotypesH2,H3,andH8weremoreevolvedhaplotypes.The2originalhaplotypesweredetectedinthelocalvarietiesofHengxianCounty,andthehaplotypesinHengxianareawerethemost.ItwasspeculatedthattheHengxianareawastheoriginanddiversitycenterofGuangxipearslandraces.Keywords:pear;landraces;chloroplastDNA;geneticdiversity我國是梨屬植物的起源中心，也是栽培梨多樣性中心之一，起源于中國的梨屬物種有13種。廣西位于我國梨樹分布最南的地區(qū)之一，栽培品種均屬砂梨系統(tǒng)，主要為7月中旬前后成熟的青皮砂梨和8月中下旬成熟的黃皮砂梨[1]。梨地方品種經過漫長的自然選擇和人為選擇，具有優(yōu)異性狀和生態(tài)適宜性，是梨育種的重要材料來源，對其遺傳多樣性水平的評價，可指導梨種質資源的收集、保護和利用。被子植物葉綠體DNA的非編碼區(qū)域變異豐富且具有母系遺傳的特性，基于此特性，近年來對葉綠體DNA的非編碼區(qū)域的測序應用到遺傳多樣性[2]、系統(tǒng)發(fā)育、起源與演化[3]等研究領域，特別是accD-psaI基因間隔區(qū)域，岳小燕[4]利用這一基因間隔區(qū)福建省梨地方品種的遺傳多樣性，F(xiàn)erradini[5]利用其分析古老的意大利梨地方品種的系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究利用葉綠體DNA變異豐富的基因間隔區(qū)域accD-psaI，通過對54份廣西梨地方品種該區(qū)域的雙向測序，分析品種的親緣關系和遺傳多樣性水平，并通過和42份梨主栽品種做比較，分析廣西梨地方品種的起源與演化，為挖掘當地的特異梨種質，更好的保護地方品種，提高其在梨育種實踐方面的利用提供理論依據。材料與方法材料2018年4月從國家果樹種質興城梨、蘋果圃和國家果樹種質武昌砂梨圃采集起源于廣西的梨地方品種的54份作為供式材料，品種及葉綠體單倍型信息見表1。表1材料信息及單倍型種類Table1PlantmaterialsinformationandcpDNAhaplotypes編號種質名稱起源單倍型編號種質名稱起源單倍型1廣西梨廣西H328橫縣浸泡梨廣西橫縣H32北流青梨廣西北流H129母豬梨1號廣西橫縣H43北流蜜梨廣西北流H130母豬梨2號廣西橫縣H44北流黃梨廣西北流H331橫縣澀梨廣西橫縣H45香蕉梨廣西德保H132橫縣酸梨廣西橫縣H56細皮糖梨廣西恭城H133靖西糖梨廣西靖西H17黃皮長把糖梨廣西恭城H334靖西雪梨廣西靖西H18青皮酸梨廣西恭城H335靖西冬梨廣西靖西H19黃皮酸梨廣西恭城H336靖西青皮梨廣西靖西H210黃皮雪梨廣西恭城H637荔浦黃皮梨廣西荔浦H111灌陽糖梨廣西灌陽H138荔浦雪梨廣西荔浦H112灌陽水南梨廣西灌陽H139三門江黃梨廣西柳城H313灌陽黃皮萼梨廣西灌陽H140三門江沙梨廣西柳城H314黃皮鵝梨廣西灌陽H141柳城鳳山梨廣西柳城H315灌陽早禾梨廣西灌陽H242柳城雪梨廣西柳成H116灌陽大青皮梨廣西灌陽H343黃細皮梨廣西龍勝H117灌陽紅皮梨廣西灌陽H344黃粗皮梨廣西龍勝H218灌陽青水梨GX3廣西灌陽H345青皮梨廣西龍勝H219粗皮糖梨GX10廣西灌陽H346桂花梨廣西龍勝H220灌陽雪GX12廣西灌陽H347黃糖梨廣西龍勝H321雁山六月梨廣西桂林H148瑤山糖梨廣西南丹H222雁山青皮雪梨廣西桂林H249冰糖梨廣西南丹H223全州梨廣西桂林H350融安青雪梨廣西融安H124南寧大沙梨廣西橫縣H151融安黃雪梨廣西融安H325橫縣靈山梨廣西橫縣H152那坡青皮梨廣西田陽H126橫縣大心梨廣西橫縣H153蒼梧大砂廣西梧州H127橫縣蜜（綠）廣西橫縣H254北流花梨廣西武鳴H1DNA提取采用改良CTAB法提取基因組DNA，經1.2%瓊脂糖凝膠和Nano-200（奧盛儀器有限公司，杭州）微量分光光度計檢測，稀釋濃度至50ng/μL備用。PCR擴增與測序對accD-psaI區(qū)域擴增的引物為5’-TTATTCGATCCAATCGTACCAC-3’和5’-AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA-3’[6]對葉綠體高變異accD-psaI間隔區(qū)進行PCR擴增，擴增體系和PCR程序參照之前的研究結果[7]，經瓊脂糖檢測單一明亮條帶，純化后經公司測序（美吉生物有限公司，北京），正反雙向測序，避免出現(xiàn)堿基錯配的錯誤。數據分析利用MEGA7.0[8]軟件進行序列比對，將比對后的結果保存成fasta格式，利用DnaSPver5.10.01[9]軟件生成品種的單倍型類型，單倍型多樣性Hd，核苷酸多樣性Pi等；同時將54份廣西地方梨品種的accD-psaI序列同Genbank上得到的該區(qū)域序列比對（42份梨品種，來自白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、西洋梨和選育品種），并利用軟件Networkver4.6[10]構建Median-joiningNetwork圖。結果與分析2.1accD-psaI序列信息和單倍型多樣性對54個廣西梨地方品種的葉綠體accD-psaI區(qū)域進行序列比對和人工校正，序列長度為683-936bp，單倍型數量為6，單倍型多樣性Hd為0.710，核苷酸多樣Pi為0.64×10-3，檢測出簡約性信息位點1個，單一突變位點5個，插入/缺失（InDels）5個，長度分別是1、2、10、22和229bp，6個單倍型序列之間的差異見表2。Tajima’sD值為1.299，P>0.10時不顯著，目標序列在進化上遵循中性模型，序列可用于系統(tǒng)發(fā)育分析。表2單倍型H1~H6在accD-psaI區(qū)域的序列差異Table2mutationandInDelsinaccD-psaIregionofH1~H6305339-567399444521562-571628-629633636637-658742H10/229bpH21/1bp0/229bpH31/22bpG/CH4H5G/AH6C/TT/G0/10bp0/2bpT/AA/T注：0代表缺失，1代表插入，“/”后面是插入或缺失片段的大小。Note:0representeddeletion,1representedinsert,numberbehind‘/‘wasthesizeofInDel2.2梨cpDNA單倍型的分布在54份廣西梨地方品種中共檢測出6個葉綠體單倍型，即H1~H6，其中單倍型H1、H2和H3為常見單倍型，分別在23、9和17份梨地方品種中檢測到，單倍型H4、H5和H6為稀有單倍型，分別在3、1和1份梨地方品種中檢測到。根據梨起源地的不同劃分小組，發(fā)現(xiàn)單倍型H1分布范圍最廣，單倍型H5和H6都只在1個地區(qū)的出現(xiàn)；起源于橫縣的梨地方品種的單倍型種類最多為5個，其次為恭城，其他地區(qū)為2~3個，一些地區(qū)因為梨樣本數量少，僅檢測到1種單倍型。表3單倍型H1~H6在廣西各地區(qū)的分布Table3DistributionofH1~H6amongdifferentregionsinGuangxi編號地區(qū)數量H1H2H3H4H5H61北流3212德保113恭城51314灌陽104155桂林31116荔浦227橫縣9311318靖西4319柳城41310融安21111龍勝513112南丹2213田陽1114梧州1115武鳴1116未知11合并54239173112.3單倍型系統(tǒng)進化分析利用軟件Network4.6構建單倍型間的Median-joiningNetwork圖，葉綠體DNA的accD-psaI序列共96條，54條為廣西梨地方品種的序列，其余42條序列為對照，來自Genbank的梨5大梨栽培系統(tǒng)和育成品種。隨序列的增加在原有的6個單倍型的基礎上，出現(xiàn)了2個新的單倍型H7和H8。單倍型H4和H5位于Median-joiningNetwork圖的主干上，為原始單倍型，分別包含4和1個梨品種；mv1和mv2為可能存在的變量，H2、H3和H8位于最外端，是較進化的單倍型。原始單倍型H4和H5通過mv1和mv2延伸出3個分支，命為G1~G3，G1組含2個單倍型H1和H2，46個梨品種，與原始單倍型H4相比，含有長度為229bp的片段缺失；G2組由1個單倍型H3組成，含31個梨品種；G3組由3個單倍型H7、H6和H8組成，15個梨品種。圖1單倍型H1~H8的Median-joiningNetwork圖Fig1.Median-joiningNetworkofhaplotypesH1~H8為更好的了解廣西梨地方品種的演化，將每個單倍型所包含的品種類型可視化，如圖2所示，單倍型H4，H5，H7和H8的來源單一，H4和H5僅為廣西地方品種構成，H7為新疆梨，H8為西洋梨；單倍型H1、H2、H3和H6的組成除廣西地方品種外，也包含5個栽培梨系統(tǒng)的白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、西洋梨和育成品種；‘母豬梨1號’、‘母豬梨2號’、‘橫縣澀梨’和‘橫縣酸梨’4個地方品種的遺傳背景單一，沒有受外來品種的影響，而大部分的廣西地方品種，在演化過程中同其他地區(qū)的梨種質資源發(fā)生了基因交流。圖2單倍型H1~H8的品種構成Fig2.SpeciescompositionofhaplotypesH1~H8討論比較使用同一葉綠體高變區(qū)域accD-psaI的研究結果發(fā)現(xiàn)，廣西梨地方品種的單倍型多樣性Hd為0.710，高于福建梨地方品種的0.660[5]，略低于湖北梨地方品種的0.720[11]，可見廣西梨地方品種的遺傳多樣水平較高，處于福建和湖北兩地的梨地方品種之間。梨屬植物自交不親和，不同種之間無生殖隔離，本研究中單倍型H6，包含了砂梨、新疆梨和西洋梨的栽培梨品種。梨基因組重測序的研究[12]推測新疆梨是東西方栽培梨的種間雜交后代，本研究利用的材料較少，也發(fā)現(xiàn)新疆梨具有東西方栽培梨的遺傳背景。根據葉綠體DNA母系遺傳的特性，發(fā)現(xiàn)一些母系遺傳背景獨特的地方品種，起源于恭城的‘黃皮雪梨’與一些新疆梨和西洋梨品種的葉綠體單倍型相同，明顯區(qū)別于其他砂梨品種；起源于橫縣的‘母豬梨1號’、‘母豬梨2號’、‘橫縣澀梨’和‘橫縣酸梨’的單倍型為原始單倍型，在今后梨資源的保護和育種實踐中，建議優(yōu)先考慮這5個梨地方品種。同時橫縣的梨地方品種中檢測到原始單倍型H4和H5，也是單倍型分布最廣的地區(qū)，推測橫縣地區(qū)為廣西梨地方品種的起源分化中心。參考文獻蒲富慎，王宇霖.中國果樹志·梨[M].上海：上海科學技術出版社：1963.ChenT,ChenQ,LuoY,etal.PhylogeographyofChinesecherry(PrunuspseudocerasusLindl.)inferredfromchloroplastandnuclearDNA:insightsintoevolutionarypatternsanddemographichistory[J].PlantBiol,2015,17(4):787-797.FerradiniN,LancioniH,TorricelliR,etal.CharacterizationandphylogeneticanalysisofancientItalianlandracesofpear[J].FrontiersinPlantScience,2017,8:751.XiaoyanY,Xiaoyan,YuZ,etal.CombinedAnalysesofChloroplastDNAHaplotypesandMicrosatelliteMarkersRevealNewInsightsIntotheOriginandDisseminationRouteofCultivatedPearsNativetoEastAsia[J].FrontiersinPlantScience,2018,9:591.岳曉燕,黃新忠,宗宇等.福建省梨地方品種的遺傳多樣性研究[J].園藝學報,2015,42(1):119-130.LiuJing,ZhengXiao-yan,PotterD,etal.GeneticdiversityandpopulationstructureofPyruscalleryana（Rosaceae）inZhejiangProvince,China[J].BiochemicalSystematicsandEcology,2012,45: