高通量測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用及常見(jiàn)問(wèn)題

2022高通量測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用及常見(jiàn)問(wèn)題（全文）近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析的迅猛發(fā)展，高通量測(cè)序，又稱下一代測(cè)序（nextgenerationsequencing，NGS）技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用不斷深化，主要體現(xiàn)在感染性疾病檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)及伴隨診斷、遺傳性疾病診斷等方面。測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，直觀而深刻地揭露了核酸分子的深層信息，為人類(lèi)進(jìn)一步探索人類(lèi)疾病提供了決定性的技術(shù)手段。但是，由于NGS檢測(cè)步驟繁瑣、流程復(fù)雜，對(duì)結(jié)果分析解讀要求高，具有一定局限性。一、NGS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用NGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用：感染性疾病仍是全球范圍發(fā)病和死亡的重要因素，病原學(xué)診斷對(duì)感染性疾病的精準(zhǔn)診療具有重要的意義。NGS技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括：（1）宏基因組二代測(cè)序mNGS宏基因組二代測(cè)序mNGS(metagenomicnext-generationsequencing）能夠直接檢測(cè)患者標(biāo)本中的所有遺傳物質(zhì)，包括樣本中多種類(lèi)型的病原體，如細(xì)菌、分枝桿菌、RNA和DNA病毒、酵母、霉菌等。研究表明：mNGS能夠成功鑒別診斷多個(gè)部位的感染，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、呼吸道、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)等。缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，步驟繁多，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。（2）多重靶向測(cè)序tNGS多重靶向測(cè)序tNGS（targetednext-generationsequencing）是基于超多重PCR和二代測(cè)序技術(shù)的新型病原微生物檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)多種類(lèi)型的已知病原體，包括細(xì)菌、病毒、真核生物，其優(yōu)點(diǎn)是特異性和靈敏度高、性價(jià)比高，能同時(shí)對(duì)特定物種的耐藥基因及毒力因子基因進(jìn)行分析，周轉(zhuǎn)時(shí)間短等；缺點(diǎn)是檢測(cè)范圍有限，無(wú)法識(shí)別新的病原體或耐藥位點(diǎn)。（3）全基因組測(cè)序WGS全基因組測(cè)序WGS（wholegenomesequencing）能夠?qū)φ麄€(gè)病原體基因組進(jìn)行測(cè)序，識(shí)別抗生素耐藥譜，從而為臨床用藥提供依據(jù)。缺點(diǎn)是大部分細(xì)菌測(cè)序需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，去除其他微生物的污染。雖然WGS檢測(cè)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)已知的耐藥基因，但新發(fā)突變對(duì)表型的影響給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)了許多不確定性。NGS在腫瘤診斷、靶向治療以及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用：NGS可用于腫瘤診斷，識(shí)別癌癥中常見(jiàn)的基因變異，包括單核苷酸變異(singlenucleotidevariationSNV)、小片段插入缺失、拷貝數(shù)變異(copynumbervariation，CNV)以及某些惡性腫瘤中的融合基因。目前靶向基因測(cè)序是臨床實(shí)驗(yàn)室腫瘤診斷的首選方法，與全基因組測(cè)序(whole-genomesequencing，WGS)與全外顯子測(cè)序(whole-exomesequencing，WES)相比，具有測(cè)序質(zhì)量高、結(jié)果易分析、成本效益低和周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。NGS還用于液體活檢中循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)專家共識(shí)建議可應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期實(shí)體腫瘤的伴隨診斷、靶向耐藥機(jī)制的識(shí)別以及預(yù)后監(jiān)測(cè)等。NGS在遺傳病診斷中的應(yīng)用：NGS技術(shù)的發(fā)展逐漸改變了遺傳疾病診斷的方式。傳統(tǒng)遺傳病的研究方法是從臨床表型到基因型分析，即所謂的“正向遺傳學(xué)”研究方法。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，形成了以遺傳信息為基礎(chǔ)確定表型的“反向表型”研究方式，使臨床醫(yī)生能夠根據(jù)個(gè)體的遺傳變異準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病及相關(guān)臨床表現(xiàn)。根據(jù)不同文庫(kù)構(gòu)建方式，可分為全基因組WGS、全外顯子WES、醫(yī)學(xué)外顯子、靶向基因測(cè)序等。常用的研究方法包括：使用WES或WGS分析具有相同臨床特征的一組患者，可篩選出不同患者中的相同變異；先證者與父母或其他家庭成員同時(shí)進(jìn)行WES或WGS分析，可根據(jù)疾病遺傳模式(常染色體顯性、隱性、X連鎖或新發(fā)變異)篩選出致病變異。二、NGS在臨床應(yīng)用中存在的問(wèn)題隨著分子生物學(xué)和科學(xué)技術(shù)的不斷提高，高通量測(cè)序技術(shù)在短短20年內(nèi)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，特別是“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念的提出，使高通量測(cè)序技術(shù)成為精準(zhǔn)醫(yī)療的重要技術(shù)保障。盡管如此，高通量測(cè)序平臺(tái)依然存在許多亟待改進(jìn)和完善之處。目前主流的高通量測(cè)序平臺(tái)序列讀長(zhǎng)較短，且依賴于PCR擴(kuò)增技術(shù)，容易造成讀取序列的誤差與偏好性，給后期生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析處理造成了較大的困難，從而影響結(jié)果的檢出。NGS結(jié)果解讀高度依賴后續(xù)生物信息學(xué)分析。目前基于NGS數(shù)據(jù)的分析流程仍處于不斷更新完善階段，標(biāo)準(zhǔn)化程度有待提高。NGS檢測(cè)結(jié)果分析與判讀易與臨床脫節(jié)，造成結(jié)果的偏差，進(jìn)而影響治療。展望作為一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的技術(shù)，NGS極大推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病診斷、遺傳病篩查、腫瘤臨床診斷、藥物基因組學(xué)檢測(cè)、單基因疾病篩查或診斷、癌癥的化療與治療等方面，為實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化臨床診療奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，NGS在實(shí)際應(yīng)用中也面臨諸如檢測(cè)流程及質(zhì)量管理體系不完善、結(jié)果分析與臨床脫節(jié)等問(wèn)題。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展與完善、相關(guān)應(yīng)用指南與規(guī)范的逐步出臺(tái)，相信NGS技術(shù)將更好地服務(wù)于精準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)踐。參考文獻(xiàn)鮑蕓，肖艷群，王華梁.高通量測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用及質(zhì)量管理.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2022,45(11):1099-1103.姜曉峰.高通量測(cè)序在臨床分子診斷中的應(yīng)用與展望.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017,32（4）:250-254.美格醫(yī)學(xué)助力臨床精準(zhǔn)抗感染：（1）宏基因組二代測(cè)序mNGSMagiSeqmNGS項(xiàng)目檢測(cè)范圍基于能提供廣域搜索、并持續(xù)更新的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，包含約有60萬(wàn)+株微生物參考基因組，檢測(cè)展示的結(jié)果主要來(lái)源于經(jīng)過(guò)細(xì)致整理、可精確鑒定的微生物種類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)，總共23796種。細(xì)菌10177；（真菌2219黑?J堂寄生蟲(chóng)*3其他197-__‘-***'^*1—-__-****~'"v真他包固支原悚，衣原俄立克底氐體，唉立克片、茹晦圖：mNGS檢測(cè)范圍（2）多重靶向測(cè)序tNGStNGS是mNGS技術(shù)的補(bǔ)充，解決mNGS受人源基因組及背景菌基因組干擾的問(wèn)題；解決mNGS對(duì)結(jié)核、真菌、胞內(nèi)菌等檢出率低的問(wèn)題；解決mNGS檢測(cè)技術(shù)對(duì)RNA病毒檢測(cè)難度大的問(wèn)題；解決mNGS對(duì)耐藥基因及毒力因子基因檢測(cè)難點(diǎn)的問(wèn)題