植物生理學綜合實驗課件

植物生理綜合實驗細胞死活與H2O2鑒定

學號姓名植物生理學綜合實驗一實驗目的：

1.了解信號物質(zhì)、激素對植物子葉的影響2.掌握細胞死活與過氧化氫鑒定方法二實驗原理：

植物受到一些物質(zhì)處理時，會作出相應的反應。產(chǎn)生活性物質(zhì)（信號物質(zhì)）。一些細胞甚至會死亡。這些反應可被檢測。植物生理學綜合實驗三實驗內(nèi)容：

一、茉莉酸甲酯對黃瓜子葉的作用二、一些物質(zhì)對茉莉酸甲酯作用的影響1.SNP/Hb2.乙烯利/CoCl2

3.H2O2供體/H2O2清除劑SNP（硝普鈉）是NO的供體，而NO是重要的植物信號物質(zhì)。ETH（乙烯利）是乙烯供體，乙烯是一種植物生長激素。H2O2是信號物質(zhì)，也是強氧化物。可以被檢測。植物生理學綜合實驗觀察和測定指標

1.觀察茉莉酸甲酯處理黃瓜子葉的影響

2.細胞死活鑒定（Trypanblue）

3.活性氧的檢測（DAB、NBT活性檢測）Trypanblue：臺盼藍

DAB：二氨基聯(lián)苯胺NBT：氮藍四唑

植物生理學綜合實驗1.細胞死活的鑒定（Trypanblue）

原理：臺盼藍不能穿過活細胞質(zhì)膜，只有死細胞染成藍色，活細胞不能被染色。

過程：取10片子葉到燒杯中，加入適量的臺盼藍染液，抽真空5min，使得染液滲透進入細胞；水浴煮沸2min，然后用2.5g/ml的水合氯醛（95％酒精）脫色至組織透明，觀察和拍照，死亡細胞被染成藍色。透明后的葉片也可以保存在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學綜合實驗2.過氧化氫活體組織的定位（DAB）

原理：H2O2在過氧化酶的催化下可與DAB迅速反應生成棕色化合物，從而定位組織中的H2O2。植物葉片滲透（DAB）以定位H2O2是一種應用比較普遍的組織染色方法。

取處理后的黃瓜子葉浸入1mg/mlDAB的磷酸緩沖液（0.02mol/L，pH7.0）中，抽真空5min，然后于黑暗中放置8h。將葉片置于飽和水氨醛（95％酒精）中脫去葉綠素，觀察和拍照。透明后的葉片也可以保存在在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學綜合實驗3.氮藍四唑（NBT）進行O-組織化學定位

原理：NBT在O-的作用下還原成不溶于水的藍色二甲替，此法測定靈敏度高，常用于O-的組織化學定位。取子葉放入含有0.1％NBT的10mM磷酸緩沖液中（0.02mol/L，pH7.0）中，真空滲透5min，然后將葉片置于飽和水氨醛（95％酒精）中，水浴煮沸2min進行固定和脫色，待葉綠素完全褪去后進行觀察和拍照。透明后的葉片也可以保存在在50％的甘油中，以備顯微觀察。植物生理學綜合實驗種子萌發(fā)

所用的黃瓜品種為粵秀3號，采用濾紙培養(yǎng)法萌發(fā)種子。將種子均勻地拜訪在鋪有2層濾紙的保鮮盒中，加適量的水，以傾斜保鮮盒時在角底處約有1ml水為準，置28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7d子葉處理

摘取子葉整齊地擺放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中（9cm，取10對子葉），葉面朝上，葉背面貼靠濾紙，加入不同溶液進行處理（溶液不能太多，傾斜培養(yǎng)皿時，只能有約1ml液體）。置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28℃，光照12h），培養(yǎng)1d、3d、5d取出培養(yǎng)皿觀察和拍照，然后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)7d觀察和拍照后進行下一步實驗。植物生理學綜合實驗四實驗結(jié)果分析4.1各小組的實驗結(jié)果第一組

蒸餾水

茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗

蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗

蒸餾水茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗茉莉酸甲酯（5×10^﹣4mol/L)蒸餾水植物生理學綜合實驗茉莉酸甲酯（5×10^﹣5mol/L)茉莉酸甲酯（5×10^﹣6mol/L)植物生理學綜合實驗第二組濃度為100umol/LSNP對黃瓜子葉的影響植物生理學綜合實驗200umol/LSNP處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗300umol/LSNP處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗SNP處理子葉染色后結(jié)果展示植物生理學綜合實驗第三組25umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗50umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗100umol/LHb處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗Hb處理的黃瓜子葉經(jīng)染色后的變化植物生理學綜合實驗第四組（過氧化氫）0.6%H2O20.8%H2O21.2%H2O210月23日植物生理學綜合實驗0.6%H2O20.9%H2O210月24日1.2%H2O2植物生理學綜合實驗0.6%H2O20.9%H2O210月26日1.2%H2O2植物生理學綜合實驗0.6%H2O20.9%H2O211月12日1.2%H2O2植物生理學綜合實驗第四小組

DAB染色臺盼藍染色NBT染色

H2O2處理從左到右的順序濃度分別為0.6%、0.8%、1.2%植物生理學綜合實驗0.6g/LVc處理下的黃瓜子葉第五組Vc植物生理學綜合實驗0.8g/LVc處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗1.0g/LVc處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗第六組ETH植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗第六小組ETH處理植物生理學綜合實驗25umol/LCOCl2

處理下的黃瓜子葉第七組植物生理學綜合實驗50umol/LCOCl2處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗75umol/LCOCl2

處理下的黃瓜子葉植物生理學綜合實驗第七小組植物生理學綜合實驗5×10-4mol/LMJ+300umol/LSNP第八組植物生理學綜合實驗5×10-6mol/LMJ+100umol/LHb植物生理學綜合實驗5×10-6mol/LMJ+1.0g/LETH植物生理學綜合實驗5×10-4mol/LMJ+75umol/LCOCl2

植物生理學綜合實驗第八小組植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗5×10-4mol/LMJ+1.0g/LVc第九組植物生理學綜合實驗5×10-5mol/LMJ+1.0g/LVc植物生理學綜合實驗5×10-5mol/LMJ+1.2g/LH2O2植物生理學綜合實驗5×10-6mol/LMJ+1.2g/LH2O2植物生理學綜合實驗植物生理學綜合實驗4.2實驗結(jié)果分析第一組茉莉酸甲酯由第一組的實驗現(xiàn)象可以看出，隨著茉莉酸甲酯的濃度的增高，植物衰老的現(xiàn)象越來越明顯，而且做細胞活性實驗后，也是隨著茉莉酸甲酯的濃度越高，葉片也從透明到逐漸染成深色，這是因為隨著茉莉酸甲酯的濃度越高，導致子葉片的死細胞也會越來越多，所以葉片的染色也是越來越深。茉莉酸甲酯在植物生長和發(fā)育過程中是體現(xiàn)出類似激素的作用，能夠促進種子的萌發(fā)，植物的生長、開花、還能促進葉片的衰老，塊莖形成，果實成熟等。從第一組的實驗可以看出茉莉酸甲酯促進了葉片的衰老，并且濃度越高，對細胞的衰老作用就越強。植物生理學綜合實驗第二組硝普鈉SNP

從第二組的實驗現(xiàn)象可以看出，隨著硝普鈉的濃度越來越高，子葉的衰老現(xiàn)象就越來越不明顯，葉片的死細胞也越來越少，染色現(xiàn)象也越來越淺。這是由于，硝普鈉SNP是NO的供體，隨著硝普鈉SNP的濃度越高，那么培養(yǎng)基中的NO的濃度就越高。NO是具有生物活性和信號轉(zhuǎn)導作用的易擴散分子，是植物細胞生長發(fā)育以及生理活動的調(diào)節(jié)因子。它不僅對植物的許多生命活動如種子萌發(fā)、葉片擴展、根系生長、逆境生理以及細胞的程序性死亡等具有直接的生理調(diào)節(jié)功能，而且作為防御反應中的關(guān)鍵信使。NO對植物凋亡有調(diào)控作用，對植物葉片的衰老的誘導作用與乙烯相似?？梢酝ㄟ^調(diào)控NO的濃度水平來調(diào)節(jié)細胞凋亡的進程。NO對子葉的影響就是延緩子葉的衰老。植物生理學綜合實驗第三組牛血紅蛋白Hb

牛血紅蛋白，NO是具有生物活性和信號轉(zhuǎn)導作用的易擴散分子，是植物細胞生長發(fā)育以及生理活動的調(diào)節(jié)因子。它不僅對植物的許多生命活動如種子萌發(fā)、葉片擴展、根系生長、逆境生理以及細胞的程序性死亡等具有直接的生理調(diào)節(jié)功能，而且作為防御反應中的關(guān)鍵信使。NO對植物凋亡有調(diào)控作用，對植物葉片的衰老的誘導作用與乙烯相似?？梢酝ㄟ^調(diào)控NO的濃度水平來調(diào)節(jié)細胞凋亡的進程。本實驗通過添加牛血紅蛋白，作為NO的清除劑，具有降低植物細胞內(nèi)NO濃度而起到對細胞生長衰老的調(diào)節(jié)作用。植物生理學綜合實驗第四組H2O2過氧化氫從實驗結(jié)果可以看出，過氧化氫的濃度越高，那么葉片的衰老速度也就越快，在測細胞的活性時，所對應的葉片的染色就越深，說明，高濃度的過氧化氫是促進葉肉細胞衰老的，導致在高濃度的情況下葉片的死亡細胞就越多。H2O2是信號物質(zhì)，也是強氧化物。過氧化氫對植物葉片的生長具有促進衰老的作用。H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而加速細胞的衰老和解體，是信號物質(zhì)，也是強氧化物。

植物生理學綜合實驗第五組Vc

從第五組的實驗現(xiàn)象來看，葉片并沒有因為維生素C的在培養(yǎng)基中的含量增多而促進葉肉細胞的衰老，反而是因為維生素C含量的增多延緩了葉片的衰老。那是由于維生素C是過氧化酶的清除劑，H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而加速細胞的衰老和解體，是信號物質(zhì)，也是強氧化物。而當加入維生素C時，則就抑制了過氧化物的作用，從而，抑制植物葉片的衰老。植物生理學綜合實驗第六組ETHETH是乙烯利，是乙烯的供體，它既能促進營養(yǎng)器官的生長，又能影響開花結(jié)果，并且在植物抗逆中發(fā)揮作用。乙烯是一種氣體，是能夠促進衰老的植物激素。這樣是符合我們的實驗結(jié)果的，隨著ETH的濃度升高，在培養(yǎng)皿中釋放的乙烯濃度也越來越高，葉片的衰老現(xiàn)象也越來越明顯，相對應的葉片的染色也越來越深。植物生理學綜合實驗第七組CoCL2

CoCL2對葉片對起延緩衰老的作用。適宜范圍濃度的鈷對植物種子萌發(fā)，幼苗生長具有一定的促進作用，鈷有可能通過調(diào)節(jié)活性酶和乙烯的代謝而發(fā)揮其生理作用。鈷是乙烯合成的一種