2024核酸抽提經(jīng)驗及原理五篇范文

第頁核酸抽提經(jīng)驗及原理五篇范文第一篇：核酸抽提經(jīng)驗及原理核酸抽提經(jīng)驗及原理

核酸抽提經(jīng)驗及原理1：核酸抽提原理簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑（如sds、tritonx-100、np-40、tween20等）和鹽（如tris、edta、nacl等）。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境（如tris），還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞（如edta）、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（如nacl）等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（如git、guhcl等）裂解的，該方法已經(jīng)成為了rna抽提的主流，卻不是基因組dna抽提的主流。最常用的純化方法，一是pc抽提+醇沉淀，二是介質(zhì)純化。第一種方法是利用pc對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了pc操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的pcr。其它雜質(zhì)–如多糖、多酚等-的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。2：了解你的實驗樣品如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點復(fù)雜時，抽提核酸的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組dna，怎么可能成功。失敗了又怎么知道原因所在。同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。對一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組dna是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下-20c保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液最好只保存有核細胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實驗室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。3：裂解方法的評價含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組dna的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組dna相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組dna是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組dna“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組dna的純度更高。另外一個思路是，如果基因組dna與蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組dna的特性占優(yōu)勢，則純化時以dna的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致dna的損失。有些樣品，如肌肉，即使是rna抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)），原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組dna抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟性及操作簡單很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用pc抽提的差一些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑（如git、guhcl等）的裂解方法，是抽提rna的首選?？俽na的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組dna相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的rna酶，從而確保了rna的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品–主要是植物，其它絕大部分樣品的rna的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組dna抽提，非常快速簡單，但純度不是很高。含ctab的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組dna抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是ctab的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。ctab的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的ctab，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除ctab要比其它的鹽難一些，同時，ctab的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用65c；但

如果發(fā)現(xiàn)降解嚴重或者得率太低，可以試一下37c–45c這個相對低溫的區(qū)域。sds堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組dna污染的特點?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4c會更好一些，所以，加入溶液iii后在4c靜置一段時間以及采用4c離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用pc純化，但結(jié)合pc純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。rna的去除可以靠在溶液i中加入rnasea（100ug/ml）或者在最后的溶解液中加入rnasea（25ug/ml）來實現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液i中使用rnasea，rna的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除rna殘留。另外，對大質(zhì)粒（50kb以上），該方法可能會有問題。pcr模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于pcr，非常快速。也正因為不純化，所以，假陰性（即沒有擴增出來的陽性）比例也比較高。該方法最簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點的就會含有一些不會抑制后續(xù)的pcr反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制pcr反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如tritonx-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點的就會含有諸如chelex100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著pcr的抑制物量的降低。選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如1ml裂解液可以用于tmg組織或者c個細胞；我的建議是，你的樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因為1ml裂解液可以抽提100mg樣品，就一定使用100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果（純度及得率）沒有關(guān)系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務(wù)必牢記。4：純化方法評價pc抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。pc抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品（雜質(zhì)為蛋白質(zhì)），該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次pc抽提都會損失一部分核酸（因為不可能將水相全部移?。?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。pc抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。pc抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組dna造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組dna，但該破壞作用不會強烈到dna變成10kb以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組dna的片段，大部分會大于20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對pcr和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻–此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組dna會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4c離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。pc抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除dna的特點，在rna抽提時獲得dna殘留極少的rna。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用pc抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與pc抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了pc抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度（蛋白質(zhì)殘留）不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4c會更好一些。介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高（雖然純度不一定比pc純化方法更高）。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀（如glassmilk、磁性小珠等）。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀

差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力（不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留）。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。5：醇的沉淀醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽–的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。就核酸而言，標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來（當(dāng)然，得率可能會降低）。知道這一點的意義在于：不要迷信標準方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標準方法碰到問題–主要是純度問題–時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。最有參考價值的是trizol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀（量少，洗滌不是問題，不丟失為先），大量核酸用乙醇沉淀（量大，丟失不是問題，洗滌方便為先）。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過（我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋恚y道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀。）；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。peg、licl、ctab都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。licl可以沉淀rna以去除dna，ctab可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。peg是沉淀病毒顆粒的方便手段。6：洗滌洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時（使核酸沉淀最終蓬松）；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。最關(guān)鍵的，洗滌一定要用室溫的75%乙醇。7：核酸的溶解和保存純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中rna以水為主，dna則多以弱堿性的tris或者te溶解。經(jīng)典的dna溶解方法多提倡使用te溶解，認為edta可以減少dna被可能殘留下來的dnase降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，dnase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用tris或者水（ph接近7）溶解dna。基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實驗人員發(fā)現(xiàn)，-20c保存的dna比-70c保存的穩(wěn)定，我卻寧可認為這是個例。如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的ph值不合適

導(dǎo)致的水解（rna在弱酸性更穩(wěn)定，而dna在弱堿性更合適）。還有一個不為人重視的，就是ep管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達到某種均衡。ep管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入geletin，glycogen，bsa可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當(dāng)回事?，F(xiàn)在制造ep管的材料遠多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純pp材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn)denaturedcc、multimericformsofcc等等帶型。8：核酸質(zhì)量的檢測問題將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大（超出電泳分離范圍），該方法還是非?？尚诺?；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始。（沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真。）其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚（后者是我目前每次都使用的方法，非常簡單；具體道理可以見我以前的帖。）最后，要記住讀數(shù)a230：a260：a280=1：2（dna為1.8）：1為理論上的數(shù)據(jù)，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。有兩個值得商榷的觀點：如果a260/a230>2就是純的，如果a260/a280>2.3就是核酸降解。a260/a230如果比2.0大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的（具體是什么雜質(zhì)我不知道）。如果核酸抽提好后立即就測定，a260/a280>2.3決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致a260/a280>2.3的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的a260/a280實際是a262/a282甚至a264/a284的值。純的核酸的吸光值，在a230是谷底，在a260是峰頂，在a280則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚?，在半山坡的斜率最大的特點，不難得出如下結(jié)論：a230和a260的讀數(shù)受儀器準確性的影響比較小，而a280受儀器準確性的影響比較大。建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用（如降解太厲害），以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考（降解的不必要測了，要測的該取多少量等）。9：問題解答a抽提過程中的現(xiàn)象及可能的原因i：核酸不溶解或者難溶解–蛋白質(zhì)殘留（雖然目前更多的資料強調(diào)的是過分干燥所致。）。75%乙醇洗滌后，如果是空氣干燥，幾乎不可能過分干燥的，尤其是在南方潮濕的地方。佐證實驗：撕取少量merck的絲狀ctdna到一個離心管中，加入無水乙醇；10分鐘后徹底去除乙醇；待乙醇完全揮發(fā)后，加入te，10分鐘后溶液就非常均勻而粘稠了。ii：使用異丙醇沉淀核酸，沉淀為白色–多糖殘留。iii：核酸溶解后為乳白色–多糖殘留。iv：75%乙醇洗滌異丙醇沉淀的核酸時，沉淀變大了–見10-iii。b紫外檢測i：a260/a280比值低–蛋白質(zhì)殘留。但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。ii：a260值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差–苯酚殘留。c電泳中的現(xiàn)象及可能的原因i：加樣孔有熒光–首先一定有dna的滯留；其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能導(dǎo)致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會被eb染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組dna（>50kb），如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時候，是比較大的dna與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔

而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強的結(jié)合能力（基因組dna的pcr產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強度與體系的特異性成反比。）。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。我的經(jīng)驗是：蛋白殘留的熒光有點發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。ii：總rna非變性電泳顯示過多的條帶–根本就不是問題。iii：總rna非變性電泳顯示28s不如18s亮，但條帶清晰無彌散–多提示28s沒有被eb飽和。rna殘留多時，基因組dna的電泳也會有相似現(xiàn)象。簡單的補染可以解決此問題。再次電泳時，或者降低上樣量，或者增加膠中eb的量。d降解的現(xiàn)象、原因及對策降解的現(xiàn)象，如果拋開問題電泳所致，可以簡單總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時還伴隨下列的一個或者多個現(xiàn)象，則需要更進一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在徹底勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總rna抽提為例，本站就有帖總結(jié)為：總rna的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細胞、貼壁細胞、組織（此處的質(zhì)量不僅指純度，也指完整性才對）。徹底裂解懸浮細胞的時間最短，徹底裂解組織的時間最長，這就是降解多發(fā)生在徹底勻漿之前的一個佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是，有許多實驗室并不具備嚴格的保存手段，實驗人員的操作也并非完美，其結(jié)果就是核酸的降解。rna抽提受的影響因素太多，就以基因組dna的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶k的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻徹底，可以預(yù)期的降解為：細胞–不應(yīng)該降解，碾碎的組織–不應(yīng)該降解，大塊組織（包括鼠尾）–部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。說得更極端一點，即使蛋白酶k失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細胞的基因組dna在抽提過程中間不被降解。減少或者杜絕核酸降解，一定要將重點放在樣品被徹底勻漿之前。樣品的保存在前面已經(jīng)說過了，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被徹底勻漿之間的時間。e后續(xù)酶反應(yīng)失敗資料書中連篇累牘的原因我就不說了，因為都對。我相信因為大家首先相信的就是它們，所以碰到問題首先一定會從那些方面著手。如果三次實驗后，問題還沒有解決，那么90%的可能在于洗滌方式的不嚴格導(dǎo)致的小分子物的殘留。小分子物像刀，可以陸續(xù)“殺”死很多酶；大分子物如蛋白質(zhì)，像繩子，只能“捆住”一個目的核酸或者酶。更嚴格的洗滌可以解決該問題。f蛋白質(zhì)是如何殘留的pc純化：a-取上清時取到中間層及下層；b-pc用量不足；c-混勻不徹底；d-溶解于上清中的少量pc中含有的蛋白質(zhì)。高鹽沉淀：a-取上清時取到了蛋白沉淀；b-裂解不徹底；c-裂解液用量不足，使裂解體系太粘稠；d-溶解度問題（可以使用低溫沉淀加以改善）。介質(zhì)：a-裂解不徹底；b-裂解體系太粘稠。g小分子物質(zhì)（苯酚、鹽）是如何殘留的醇沉淀：洗滌不徹底。其原因與管子、操作手法等有關(guān)。介質(zhì)：顆粒狀介質(zhì)的原因與醇沉淀相同。柱式的幾乎都是柱子設(shè)計上的缺陷所致，極少數(shù)由操作者未嚴格按要求操作所致。10：某些我使用的操作手法實驗做多了，的確希望能偷點懶；偷懶也有講究，否則就是偷雞不成失把米。下面就是一些在確保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起來很麻煩，但請想一想抽提失敗后的再次抽提，應(yīng)該是可以算偷懶的方法了：i：混勻操作（1.5ml離心管內(nèi)）–如果液體體積在100ul以內(nèi)，用指頭彈擊尖底混勻；在100-400ul之間，用振蕩器混勻；大于400ul，用手晃動混勻：晃動時使離心管底永遠處于斜上位置，頻率要快。ii：pc抽提時上清的移取–離心管傾斜，根據(jù)上清的量選擇不超過200ul的移液器，在外面先壓下移液器，再將tip移入上清。tip要盡可能靠近液面，tip的尖嘴接觸內(nèi)壁，緩緩松手吸取上清?？啥啻我迫?，但決不要使用1ml移液器。iii：核酸的洗滌–核酸沉淀后離心，將上清倒掉。如果核酸是來源于雜質(zhì)比較多的樣品（如植物、動物肝臟、細菌等），則在加入75%乙醇之前，再將離心管短暫離心后，用移液器將殘留液體徹底吸出，否則，75%的乙醇非常容易將殘留液體中的多糖等雜質(zhì)給沉淀下來。移取75%乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后將核酸徹底懸浮起來，置于室溫一段時間（時間長短取決于

沉淀大?。陂g多混勻幾次。如果去除75%乙醇的操作是“離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體”，則洗滌2次；如果去除75%乙醇的操作是“離心后倒掉”，則洗滌3次，但最后一次仍然采用“離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體”。這樣洗滌的目的，是確保小分子物的殘留低于10萬分之一（最大殘留不高于10um級）。11：一些特別的問題a：ep管的問題幾乎沒有人會認為ep管的質(zhì)量會與核酸抽提的操作有關(guān)，與某些現(xiàn)象（如核酸在-20c保存一天后發(fā)生了降解）有關(guān)系，但事實是，ep管的質(zhì)量的確與核酸抽提的質(zhì)量以及核酸保存時的穩(wěn)定性有關(guān)。硅化可以提供最高質(zhì)量的ep管，使某些奇怪的現(xiàn)象消失或者大大減輕。最糟糕的ep管對液體有較強的吸附力，在傾倒液體時殘留多，核酸在管中保存的過程中會發(fā)生變性。這樣的管子是很有市場的，因為便宜；而正因為便宜，其材料總是不令人放心的。我個人認為，只有硅化過的ep管，才可能按照標準操作獲得滿意的結(jié)果。否則，某些操作步驟必須調(diào)整，才可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)量。b：核酸抽提中的溫度問題核酸抽提中的溫度問題，也是一個值得關(guān)注的問題。首先要明確的一點是，任何一個溫度條件，對某些方面有利，同時也一定會有不利的一面。如沉淀，低溫操作會提高得率，但也會增加雜質(zhì)的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應(yīng)該是利弊權(quán)衡的結(jié)果?；旧?，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是最好的選擇。那些認為“低溫操作可以防止或者減少降解”之類的理由，并沒有多少可操作性的。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，此消彼長，沒有辦法給出結(jié)論的。就rna抽提而言，徹底勻漿前在冰上操作可以降低rna被降低的風(fēng)險，徹底勻漿后的溫度對rna的完整性影響已經(jīng)不會大的；如果發(fā)現(xiàn)影響很大，說明rnase沒有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更沒有道理的是認為低溫沉淀和低溫洗滌可以防止降解了。事實上，核酸一旦被沉淀下來，對酶的耐受力是很強的，這就是核酸保存在醇溶液中最穩(wěn)定的理論基礎(chǔ)。如果說沉淀使用低溫還可以提高得率，洗滌使用低溫又是為什么。徹底的錯誤而已。c：如何閱讀操作手冊拿到操作手冊后，要倒著閱讀：先閱讀問題解答，再看操作步驟下面的說明，再看操作步驟。問題解答是別人在使用過程中曾經(jīng)碰到過的問題集錦，操作步驟下面的說明是商家的警告。沒有一個商家會將他的操作步驟寫得非常復(fù)雜，因為這是滿足使用人員習(xí)慣的結(jié)果。一句話，ps和bytheway之類的話中含有真正的有用素材。12：延伸的思考a：標準化的概念所謂的標準化，指的是一套程序，確保不同的人能獲得質(zhì)量接近的產(chǎn)物的程序。標準化并不是以獲得最高質(zhì)量為目標，而是以穩(wěn)定為目標。標準化的核心是質(zhì)控。事實上，核酸抽提的每一步操作，都有一個核心；重要的是找到可觀察的指標或者現(xiàn)象作為參考，從而確保實驗的成功。如懸浮的核心是沒有塊狀物的存在，徹底消化的核心是沒有塊狀物的存在，pc抽提的核心是混勻-兩相成為乳狀，取上清的核心是用小一點的移液器移取液體，吸取時tip的尖頭盡可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下1mm以上的液體不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暫離心將殘留液體離到管低，用移液器徹底移出。洗滌的核心是徹底懸浮沉淀，并且要放置一段時間（時間長短與沉淀大小有關(guān)）使沉淀內(nèi)部也能被洗滌到。按這樣的方法抽提的核酸，其質(zhì)量是非常穩(wěn)定的。柱離心式實際上就是非常標準化的核酸沉淀與洗滌的操作。一般而言，如果嚴格按照操作步驟去做了，柱式操作出問題，系統(tǒng)性的與試劑盒有關(guān)，偶然性的與操作有關(guān)。這一點，應(yīng)該是可以理解的。一個方法，其標準化程度越高，其穩(wěn)定性就越好。步驟越少，標準化就越容易。產(chǎn)品的開發(fā)也要以高標準化程度為目標。b：qc的概念qc（質(zhì)控）概念遠沒有qt（質(zhì)檢）概念深入人心。最高境界的產(chǎn)品追求的是免檢，或者是trouble-free。另外，現(xiàn)在的許多產(chǎn)品也是不允許qt的（因為是一次性的），因此就只能靠qc來保證質(zhì)量了。qc是將精力集中在過程中：原料、操作等。只要嚴格按照標準去做，最終的結(jié)果就有保證。事實上，很多實驗人員是不做檢測而直接將抽提好的核酸用于后續(xù)實驗的；他們之所以可以這么做，是因為他們有意無意之中非常的注意qc。也有不少人，尤其是新手，paynoattentiontoqc，只知道最后的qt。一旦發(fā)現(xiàn)問題，就去逆推原因；但因為過程中所出現(xiàn)的現(xiàn)象根本就沒有注意，幾乎不可能準確找出真正的原因的。如果qc做得好，最后的qt是否全部做/部分做/完全不做，取決于時間、經(jīng)驗、后續(xù)實驗的成本等因素。

c：其它核酸抽提的每一步操作，都是利弊權(quán)衡的結(jié)果。消化要徹底，時間就會長；pc抽提時多取上清，得率會提高，但增加了蛋白質(zhì)污染的風(fēng)險；沉淀使用低溫且延長時間，得率會提高，但增加了雜質(zhì)污染的風(fēng)險…不足詳列?？傊?，核酸抽提是藝術(shù)，可以根據(jù)自己的樣品及當(dāng)時的情況，對操作步驟進行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。d：實驗的思維核酸抽提的成功，就是每一步都沒有失敗。這不是玩文字游戲，而是告訴你做實驗的良好思維。就如同小學(xué)基礎(chǔ)沒有打好，早晚會發(fā)現(xiàn)大問題一樣，做實驗決不要以成功為喜悅，以失敗為痛苦。要保證實驗成功，絕對不能有“這個操作應(yīng)該沒有問題”，“用這個可能不會有問題”之類的僥幸心理。去掉任何一個可能使實驗失敗的因素，這才是實驗該有的出發(fā)點。用這樣的出發(fā)點，實驗幾乎沒有不成功的，所以說，實驗成功沒有什么快樂；實驗的快樂來自于：發(fā)現(xiàn)自認為不會導(dǎo)致失敗的某因素實際會導(dǎo)致實驗的失敗。學(xué)到了這樣的知識，才有快樂的理由。e：eb在na抽提中的運用eb在na抽提中的應(yīng)用，用于電泳，人皆盡知；用于gdna抽提時提高蛋白質(zhì)與gdna的分離效率，卻似乎沒有人再考慮了，因為大家都怕使用eb。在na抽提中涉及到eb的另外一大類，就是膠回收操作了；eb在膠回收中扮演的角色，就不完全是正面的。如果na與eb充分接觸，eb就會以每隔數(shù)個堿基的頻率均勻地插入na之中。eb的這種插入，無疑更可能破壞核酸雙鏈的穩(wěn)定性，使核酸由雙鏈變成單鏈的壓力增加。如果核酸比較短，而錯配又多（錯配的后果之一也是核酸容易由雙鏈變成單鏈），eb的插入將更容易導(dǎo)致變性的出現(xiàn)。這個觀點有如下的實驗報告佐證：有相當(dāng)部分的pcr產(chǎn)物膠回收實驗，都報告說回收后的電泳結(jié)果是：目的條帶變淡或者消失，同時出現(xiàn)了一條小的原來不存在的條帶。壇中曾有文描述他做膠回收的程序：兩邊加marker，中間加產(chǎn)物；電泳過程不含eb。電泳結(jié)束后，縱向割下marker條帶用eb染色后，放回膠原來的位置。開紫外，根據(jù)marker的位置割下目的條帶，再回收。這是個笨辦法，但這樣使用的人一定是聰明人。如果這個辦法仍然不能消除變性，則只能使用高保真的酶了。f：蛋白質(zhì)殘留的影響問題（探討，沒有證據(jù)）一直對蛋白質(zhì)殘留不抱好感，卻也沒有將它看成威力無比。本節(jié)考慮的是蛋白質(zhì)對酶反應(yīng)的影響問題，為方便表述，我將殘留的蛋白質(zhì)分成同源的（與核酸或者酶有同一或者相似的來源，如細菌）和異源的（與核酸或者酶沒有同一或者相似的來源）兩種。先看異源蛋白質(zhì)的影響：內(nèi)切酶幾乎都在保存液中添加有500ug/ml的bsa，bsa是改善pcr結(jié)果的一個選項，bsa是穩(wěn)定低濃度核酸的一個選項。幾乎都是正面的。可以看到，異源蛋白質(zhì)對酶反應(yīng)沒有抑制作用，甚至還有促進作用（雖然都是以bsa為例）。再看同源蛋白質(zhì)的影響：ambion公司有一個非常有特點的產(chǎn)品“cells-to-cdnakit”。細胞裂解后不去除蛋白質(zhì)就直接用于rt-pcr。該例子應(yīng)該可以說明，與核酸同源的蛋白質(zhì)的殘留對rt-pcr不一定有影響。另外一個例子是質(zhì)粒的酶切。質(zhì)粒酶切是比較容易出現(xiàn)一些靠pc純化一次就可以解決的問題的；因為pc純化基本上就是去除蛋白質(zhì)，所以可以認為質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)對酶切是有巨大影響的。各位看官是否注意到這兩個例子的最大區(qū)別在什么地方。區(qū)別在于殘留的蛋白質(zhì)究竟是與核酸同源還是與蛋白質(zhì)同源。事實是，質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)是宿主菌的（ecoli或者其它），與質(zhì)粒并不同源；而內(nèi)切酶卻是來自于ecoli或者其表弟表妹的，與宿主菌的蛋白質(zhì)同源性是非常高才對。還有一個現(xiàn)象：ecori的staractivity是最明顯的，其它來源于ecoli的酶的該活性也不差，這是為什么。寫到這，我頭有點痛了，因為我沒有辦法證明；就是有人提供了證明，我暫時也看不到用途。畢竟，酶反應(yīng)不是受單一因素影響的。如果說該思考有什么現(xiàn)實意義，那就是：殘留蛋白質(zhì)的危害可能被夸大；許多實驗在重復(fù)失敗，只是因為你抓住的嫌疑犯不是真兇。更大膽的假設(shè)是：bsa可以用于某些核酸抽提，以更徹底去除與酶同源的蛋白質(zhì)殘留。g：無介質(zhì)的核酸抽提裂解液（不含苯酚）的展望（供核酸抽提產(chǎn)品生產(chǎn)商及潛在的生產(chǎn)商參考）經(jīng)典的醇沉淀和洗滌，在無介質(zhì)核酸抽提技術(shù)中，幾乎是不可或缺的，盡管微調(diào)可以帶來一些意想不到的效果。能展望的，也只有裂解液了。現(xiàn)在的裂解液，都沒有同步去除蛋白質(zhì)的功能；蛋白質(zhì)的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白質(zhì)，或者靠加入高鹽溶液去除蛋白質(zhì)，效果也不錯。能做的改進，看起來也就只有配制出這樣一種裂解液：裂解效率高（得率的保證），同時蛋白質(zhì)可以靠離心去除（操作簡化了）。簡單地講，下面提供的是目前可以想象的結(jié)合有高得率、高純度、操作最簡單諸多特點的操作步驟（以細胞為例。組織搗碎后也適用）：在樣品中加入裂解液，混勻后，靜置使裂解徹底。高速離心后，蛋白質(zhì)沉淀在離心管的底部，上清則為核酸。將上清轉(zhuǎn)移到預(yù)

先已經(jīng)加入了醇的離心管中，輕輕混勻后，用一個小鉤撈出大的絮狀沉淀（以dna為主）到另外一個離心管中；撈不起來的（主要是rna）用離心沉底。分別洗滌蛋白質(zhì)沉淀，dna絮狀沉淀和rna離心的沉淀，再分別溶解，就可以同步獲得dna/rna/蛋白質(zhì)了。h：醇沉淀的語言flash–從低濃度核酸沉淀條件的改變看核酸是如何形成沉淀的核酸醇沉淀的原理，按照分子克隆中的描述，是用陽離子中和了磷酸根的負電荷后，核酸“無性”結(jié)合才能沉淀下來。低濃度核酸沉淀的條件一般要做如下改變：使用長時間的低溫、使用更高比例的醇、使用trna之類的東西。下面就用flash語言的特點，描述一下“無性”的核酸是如何結(jié)合的。溶液中的單個核酸，雖然是“無性”的，對其它的核酸，仍然是有引力的（大小與距離相關(guān)）；同時，核酸分子受到的另外一個力，來自分子運動。在一般情況下，核酸之間的引力比分子運動產(chǎn)生的力小許多；只有當(dāng)核酸之間的距離足夠近時，引力才能克服分子運動產(chǎn)生的力，使兩個核酸結(jié)合到一起。結(jié)合在一起的兩個核酸又共同對其它的核酸產(chǎn)生引力（該引力比單個核酸的要大），結(jié)合上更多的核酸…最終沉淀下來了。低溫和更高濃度的醇都有利于降低分子運動產(chǎn)生的力，trna能提高總核酸濃度進而通過與目的核酸的結(jié)合提高了目的核酸之間的引力，所以低濃度核酸的沉淀條件如上。至于2價鎂離子有利于低濃度核酸的沉淀原因，可能是鎂離子要被同一核酸分子的兩個磷酸根結(jié)合，這種結(jié)合的結(jié)果是核酸分子變得更立體了（團狀）：引力越集中，對外就越大。i：從柱離心式產(chǎn)品的流行看經(jīng)典方法的缺點（或者操作重點）柱式方法的風(fēng)行是無法否定的現(xiàn)實。下面通過柱式方法與經(jīng)典方法的比較，看一看如何注意經(jīng)典方法的操作重點。裂解，二者幾乎沒有任何區(qū)別。去蛋白質(zhì)，柱式靠的是柱材料對蛋白質(zhì)吸附力低這一特點，將蛋白質(zhì)殘留控制在比較低的水平（并不是/也不能徹底去除）；經(jīng)典方法最常用的是pc抽提，可以將蛋白質(zhì)去除得更徹底一些。其它大分子雜質(zhì)這三個特點決定了柱式的洗滌效率比經(jīng)典的洗滌效率高，所以，柱式純化的核酸純度比較高。結(jié)論是：裂解和去蛋白質(zhì)的能力，經(jīng)典方法不次于柱式方法；去除其它大分子雜質(zhì)，經(jīng)典方法不如柱式；洗滌能力，按目前各種參考書中的介紹去做，幾乎沒有辦法超過柱式方法。你看一看上面柱式方法洗滌的特點，經(jīng)典洗滌方法哪一條強調(diào)了。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗滌的特點，就應(yīng)該不會有疑問的吧。難道過去的核酸沉淀洗滌方法有錯誤。那倒不是。真正的原因是，過去核酸抽提使用的小分子物（鹽等），多是后續(xù)酶反應(yīng)中會使用到的或者起碼少量的殘留不會抑制后續(xù)酶反應(yīng)的；現(xiàn)在抽提中使用的東西就不一樣了，都是一些對蛋白質(zhì)有強烈作用的東西，而且濃度還非常高。過去有資料強調(diào)測a230值嗎。自打guanidinethiocyanate開始廣泛用于核酸抽提后，a260/a230比值的測定成為檢測質(zhì)量標準的一個非常重要的指標了。如果將洗滌操作更強化及嚴格一點，對于一般比較干凈的樣品，你會發(fā)現(xiàn)經(jīng)典方法抽提的核酸完全可以達到非常好的質(zhì)量的。柱式就還留下一個“快”的特點，當(dāng)然應(yīng)該說是“更快”。有一個無心插柳的結(jié)果供分享：加入醇沉淀基因組dna時，將沉淀挑到另外一個離心管中，挑不起來的離心使之沉淀；同樣洗滌/干燥/溶解后，同時電泳。電泳顯示：離心沉淀的加樣孔幾乎無熒光，20kb左右有一條亮帶；挑出來的加樣孔熒光非常強烈，從加樣孔到20kb之間有彌散帶，但沒有清晰的主帶。

第二篇：核酸抽提經(jīng)驗及原理總結(jié)核酸提取原理及經(jīng)驗總結(jié)

一、核酸

核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的成分。一般認為，生物進化即始于核酸，因為在所有生命物質(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾（f.miescher）在膿液的白細胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時稱之為核素。阿爾特曼（r.altmann）于1889年認識其酸性后，定名為核酸。

二、核酸的分類和功能

核酸分為核糖核酸（rna）和脫氧核糖核酸（dna）兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點，但生物功能不同。dna貯存遺傳信息，在細胞分裂過程中復(fù)制，使每個子細胞接受與母細胞結(jié)構(gòu)和信息含量相同的dna；rna主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負責(zé)將dna的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。dna和rna中的戊糖不同，rna中的戊糖是d-核糖；dna不含核糖而含d-2-脫氧核糖（核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代）。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，dna和rna的堿基也有所不同。下面我們看看dna和rna具體的差別：

（一）dna的分子結(jié)構(gòu)

1.dna的堿基組成規(guī)律：chargaff等根據(jù)分析各種生物及其不同組織內(nèi)dna樣品水解液中的堿基含量的結(jié)果，得出以下結(jié)論：1）同一生物不同組織的dna樣品，其堿基成分含量相同。2）不同生物的dna堿基成分含量不同。3）對某一生物講，其堿基成分的含量不受年齡、營養(yǎng)及環(huán)境變化等影響。4）在同一生物的dna堿基含量是a=t，g=c，a+g=c+t，堿基之間的這種關(guān)系稱chargaff法則。

2.dna分子的基本結(jié)構(gòu)。核酸分子內(nèi)單核苷酸之間的連接鍵為3'，5'-磷酸二酯鍵，是共價鍵。dna分子的基本結(jié)構(gòu)就是許多脫氧核糖核苷酸借磷酸二脂鍵相互連接而成的多核苷酸鏈。dna鏈中堿基的組成和排列順序即為dna的一級結(jié)構(gòu)。dna的遺傳信息即儲存在dna分子的堿基排列順序中。

.dna分子的空間結(jié)構(gòu)：dna的二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，其特點為：1）兩條鏈方向相反、相互平行、主鏈是磷酸戊糖鏈，處于螺旋外側(cè)。2）堿基在螺旋內(nèi)側(cè)并配對存在，a與t配對的g與c配對，a與t之間二個氫鍵相連（a-t），g與c之間三個氫鍵相鏈（g-c）。3）螺旋直徑2nm，二個堿基對平面距0。34mm，10bp為一螺距，距離為3。4nm。4）穩(wěn)定因素主要是堿基之間的氫鍵和堿基對平面之間的堆積力。

（二）rna的分子結(jié)構(gòu)

rna的基本結(jié)構(gòu)是a、g、c、u四種堿基組成的核糖苷酸通過磷酸二酯鍵相鏈而成的多核苷酸鏈。有三種主要的rna：據(jù)其作用可分轉(zhuǎn)運rna（trna）、信使rna（mrna）和核蛋白體rna（rrna），它們的二級結(jié)構(gòu)是單鏈局部雙螺旋，共中trna結(jié)構(gòu)較清楚：

1.trnatrna一級結(jié)構(gòu)特點是：1）核苷酸數(shù)目在70-90之間；2）含較多稀有堿基；3）所有trna的3'末端均是-cca的結(jié)構(gòu)。trna二級結(jié)構(gòu)特點：呈三葉草形，有三環(huán)四臂。其中3'的氨基酸臂是攜帶氨基酸的位置，ii環(huán)又稱反密碼環(huán)，此環(huán)頂端由3個堿基組成反密碼子，起到識別mrna上對于密碼子的作用。

2.mrnamrna是蛋白質(zhì)合成的模板，真核生物的mrna的5'端有m7gppp的帽子，3'末端有20-200多聚a的尾巴上述兩者之間為信息區(qū)，其中每三個相鄰堿基組成一個三聯(lián)體，代表一個氨基酸信號，即為密碼子。不同mrna具有不同的密碼順序，決定蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序（一級結(jié)構(gòu)）。

3.rrna核蛋白體rna，它是細胞內(nèi)含量最多的rna：rrna與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白體，存在于胞漿，是蛋白質(zhì)合成的部位。

三、核酸的理化性質(zhì)

rna和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，dna則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。dna、rna和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，rna鈉鹽在水中溶解度可達40g/l，dna鈉鹽在水中為10g/l，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，dna、rna易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的dna是以脫氧核糖核蛋白（dnp）形式存在于細胞核中。要從細胞中提取dna時，先把dnp抽提出來，再把p除去，再除去細胞中的糖，rna及無機離子等，從中分離dna。

四、細胞裂解：

（一）裂解原理

在核酸提取過程中，細胞裂解是非常重要的。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑（如

sds、tritonx-100、np-40、tween20等）和鹽（如tris、edta、nacl等）。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境（如tris），還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞（如edta）、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（如nacl）等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（如git、guhcl等）裂解的，該方法已經(jīng)成為了rna抽提的主流，卻不是基因組dna抽提的主流。

（二）細胞的裂解方法

細菌細胞破碎方法有以下幾種：1）機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法，關(guān)于超聲波處理法，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間。2）化學(xué)試劑法：用含sds或ctab的溶液處理細胞，在一定的ph環(huán)境和變性條件下，細胞破裂，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸被釋放到水相，ph環(huán)境則由加入的強堿（naoh）或緩沖液（te、ste等）提供，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑（edta等）可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子mg2+、ca2+，從而抑制核酸酶的活性，保護核酸不被降解。；3）反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶k等，都可使細胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸殘基間的β-（1，4）鍵水解。蛋白酶k能催化水解多種多肽鍵，其在65℃及有edta、尿素（1～4mol/l）和去污劑（0.5%sds或1%tritonx-100）存在時仍保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中，酶作用、機械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗?zāi)康膩泶_定。

（三）裂解方法的評價

含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組dna的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組dna相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組dna是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組dna“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組dna的純度更高。另外一個思路是，如果基因組dna與

蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能。如果基因組dna的特性占優(yōu)勢，則純化時以dna的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致dna的損失。當(dāng)然去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組dna抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟性及操作簡單很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用pc抽提的差一些。

高濃度蛋白質(zhì)變性劑（如git、guhcl等）的裂解方法，是抽提rna的首選?？俽na的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組dna相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的rna酶，從而確保了rna的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品–主要是植物，其它絕大部分樣品的rna的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。當(dāng)然有些樣品，如肌肉，即使是rna抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)），原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。

含ctab的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組dna抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是ctab的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。ctab的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的ctab，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除ctab要比其它的鹽難一些，同時，ctab的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用65c；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴重或者得率太低，可以試一下37c–45c這個相對低溫的區(qū)域。

sds堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組dna污染的特點?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4c會更好一些，所以，加入溶液iii后在4℃靜置一段時間以及采用4℃離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用pc純化，但結(jié)合pc純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。rna的去除可以靠在溶液i中加入rnasea（100ug/ml）或者在最后的溶解液中加入rnasea（25ug/ml）來實現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液i中使用rnasea，rna的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除rna殘留。另外，對大質(zhì)粒（50kb以上），該方法可能會有問題。

pcr模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于pcr，非?？焖?。也正因為不純化，所以，假陰性（即沒有擴增出來的陽性）比例也比較高。該方法最簡單的就是反復(fù)凍融法，簡便快捷，不需任何化學(xué)試劑，凍融離心，pcr檢測就可以了。如果使用裂解法，哪么最簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點的就會含有一些不會抑制后續(xù)的pcr反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制pcr反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如tritonx-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點的就會含有諸如chelex100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著pcr的抑制物量的降低。

（四）樣品與裂解液的比例

選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如1ml裂解液可以用于tmg組織或者c個細胞；建議：樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因為1ml裂解液可以抽提100mg樣品，就一定使用100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果（純度及得率）沒有關(guān)系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務(wù)必牢記。

五、核酸提取

核酸提取包含樣品的提取和純化兩大步驟。提取是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。

（一）dna提取的幾種方法

1濃鹽法：1）利用rna和dna在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1m氯化納提取化鈉抽提，得到的dnp粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩，使乳化，再離心除去蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而dna位于上層水相中，用2倍體積95%乙醇可將dna鈉鹽沉淀出來；2）也可用0.15mnacl液反復(fù)洗滌細胞破碎液除去rnp，再以1mnacl提取脫氧核糖蛋白，再按氯仿異醇法除去蛋白。兩種方法比較，后種方法使核酸降解可能少一些；3）以稀鹽酸溶液提取dna時，加入適量去污劑，如sds可有助于蛋白質(zhì)與dna的分離。在提取過程中為抑制組織中的dnase對dna的降解作用，在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑。2陰離子去污劑法：用sds或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取dna。由于細胞中dna與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，所以常用陰離子去污劑提取dna。

3苯酚抽提法。苯酚作為蛋白變性劑，同時抑制了dnase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與dna聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含dna的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀dna。此時dna是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的dna保持天然狀態(tài)。

4水抽提法。利用核酸溶解于水的性質(zhì)，將組織細胞破碎后，用低鹽溶液除去rna，然后將沉淀溶于水中，使dna淀溶于水中充分溶解于水中，離心后收集上清液。在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6m，加入2倍體積95%乙醇，立即用攪拌法攪出。然后分別用66%，80%，95%乙醇以及丙酮洗滌，最后在空氣中干燥，既得dna樣品。此法提取的dna中蛋白質(zhì)含量較高，故一般不用。為除蛋白可將此法加以改良，在提取過程中加入sds。

（二）rna提取

所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即１）。樣品細胞或組織的有效破碎；２）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３）對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。

1）總rna的試劑盒快速提取一些公司推出的總rna提取試劑盒，該總rna純化系統(tǒng)采用兩種著名的rna酶抑制劑，異硫氰酸?。╣tc）和β-巰基乙醇，加上整個操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低rna的降解速率。gtc和n-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使rna與蛋白質(zhì)分離，并將rna釋放到溶液中。而進一步從復(fù)合體中純化rna，則根據(jù)chomczynski和sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低ph值的酚將使rna進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和dna分離。水相中的rna可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述rna沉淀復(fù)溶于gtc溶液中，接著異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而rna中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

2）氯化鋰法提取總rna。本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制rna酶，用氯化鋰選擇沉淀rna，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織rna，具有快速簡潔的長處，但也存在少量dna的污染及rna得率不高，小rna片斷丟失的缺陷。

3）蛋白酶－熱酚法。本方法適合于病毒rna的提取。

六、核酸純化

裂解完成后，液體體系中就包括了游離的核酸、蛋白質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)、鹽：純化就是將核酸與其它游離成分分離的過程。就個人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開（peg沉淀和licl沉淀除外）。使用介質(zhì)的可以分為兩類：離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。不使用介質(zhì)的也分為兩類：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。

（一）純化方法：下面比較一下具體的純化技術(shù)：

1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)。細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25241∶∶體積）混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻（適用于分離小分子量核酸）或簡單顛倒混勻（適用于分離高分子量核酸）后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預(yù)先要用ste緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián);故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀，，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性，從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀，通過沉淀可濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入ph5.0～5.5，終濃度為0.3m的naac或kac后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復(fù)性。然后加入2～2.5倍體積的乙醇，經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑[異丙醇、聚乙二醇（peg）等]和鹽類（10.0mol/l醋酸銨、8.0mol/l的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等）也用于核酸的沉淀。

2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；

洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標準的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實驗。

4）密度梯度離心法。密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈dna、單鏈dna、rna和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒dna的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標準介質(zhì)，梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。

注。但是在日常實驗過程中，通常用的純化方法有主要有以下兩種，一是化學(xué)方法，即pc抽提+醇沉淀；二是物理方法，即介質(zhì)純化。第一種方法是利用pc對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了pc操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的pcr。其它雜質(zhì)–如多糖、多酚等的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。

（二）純化方法評價

pc（p是英文酚的縮寫，c是英文氯仿的縮寫）抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。pc抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品（雜質(zhì)為蛋白質(zhì)），該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次pc抽提都會損失一部分核酸（因為不可能將水相全部移?。约暗蜐舛群怂岬拇汲恋硇实?，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。pc抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。pc抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組dna造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組dna，但該破壞作用不會強烈到dna變成10kb以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組dna的片段，大部分會大于20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對pcr和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻–此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組dna會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4c離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。pc抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除dna的特點，在rna抽提時獲得dna殘留極少的rna。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用pc抽提的，否則核酸必定降解。

高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與pc抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了pc抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度（蛋白質(zhì)殘留）不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4c會更好一些。

介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高（雖然純度不一定比pc純化方法更高）。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀（如glassmilk、磁性小珠等）。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力（不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留）。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。

（三）醇的沉淀

1）沉淀的原理目的。目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。

就核酸而言，標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來（當(dāng)然，得率可能會降低）。知道這一點的意義在于：不要迷信標準方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標準方法碰到問題–主要是純度問題時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。最有參考價值的是trizol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。

2）沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀（量少，洗滌不是問題，不丟失為先），大量核酸用乙醇沉淀（量大，丟失不是問題，洗滌方便為先）。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過（我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋恚y道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀。）；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。當(dāng)然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還有包括peg、licl、ctab都可以用于核酸沉淀，雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。licl可以沉淀rna以去除dna，ctab可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。peg是沉淀病毒顆粒的方便手段。3）沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。

（四）核酸的洗滌

1）洗滌原理與目的。洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時（使核酸沉淀最終蓬松）；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清

可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的75%乙醇。

（五）核酸的溶解和保存

1