《水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 》

1水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中脫水紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、竹桃霉素、吉他霉素、交沙霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB17378.5海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)SL187水質(zhì)采樣技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4方法原理水試樣中的目標(biāo)物經(jīng)HLB固相萃取柱富集和凈化，底泥試樣中的目標(biāo)物經(jīng)氨化乙腈提取，PSA和C18吸附劑凈化。凈化后的溶液用帶有電噴霧離子源的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑與材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純；水應(yīng)為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.2乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.3甲酸（HCOOH）：色譜純。5.1.4氯化鈉（NaCl）。25.1.5氨水（NH3.H2O）。5.1.6無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）5.1.7乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）。5.2溶液配制5.2.10.1%甲酸水溶液：取甲酸0.5mL，用水稀釋至500mL。5.2.2甲酸-乙腈溶液：取乙腈30mL，用0.1%甲酸水溶液稀釋至100mL。5.2.31%氨化乙腈：取氨水5mL，用乙腈稀釋至500mL。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：脫水紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、竹桃霉素、吉他霉素、交沙霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星含量均≥95.0%，具體內(nèi)容見附錄A。5.3.2內(nèi)標(biāo)：羅紅霉素-D7含量≥95.0%，具體內(nèi)容見附錄A。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）：取大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各約10mg，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋至100mL，配制成濃度均為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存，有效期3個(gè)月。5.4.2內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100μg/mL）：取羅紅霉素-D7標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋至100mL，配制成濃度均為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存，有效期3個(gè)月。5.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0μg/mL）：分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。4℃避光保存，有效期1個(gè)月。5.4.4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0μg/mL）：精密量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。4℃避光保存，有效期1個(gè)月。5.5材料5.5.1HLB固相萃取柱：500mg/6mL。5.5.2PSA（N-丙基乙二胺）吸附劑：粒徑40μm～63μm或相當(dāng)者。5.5.3C18（十八烷基鍵合硅膠）吸附劑：粒徑40μm～63μm或相當(dāng)者。5.5.4微孔濾膜：0.45μm玻璃纖維濾膜和0.22μm尼龍濾膜。6儀器與設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源。6.2分析天平：感量0.01g和0.00001g。6.3冷凍干燥機(jī)。6.4渦旋混合器。36.5高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。6.6超聲波清洗器。6.7固相萃取裝置。6.8氮吹儀。6.9旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.10pH計(jì)。7樣品7.1樣品采集水樣采集應(yīng)符合SL187的要求。底泥樣品采集應(yīng)符合HJ494的要求。7.2試樣制備采集的水樣經(jīng)0.45μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾后，置于樣品瓶中，在0℃~4℃避光保存。采集的底泥樣品經(jīng)冷凍干燥機(jī)冷凍干燥后，剔除石塊和植物體等異物，用研缽研磨后過(guò)60目（孔徑0.25mm）網(wǎng)篩，在0℃~4℃避光保存。7.3空白試樣制備選取不含大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的同類樣品，按照7.2的方法制備。8測(cè)定步驟8.1提取8.1.1水量取100mL（準(zhǔn)確至±0.5mL）試樣，用甲酸調(diào)節(jié)pH至6.0(±0.2），加入50μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入0.1g乙二酸四乙酸二鈉，混合均勻。無(wú)需提取，待凈化。8.1.2底泥稱取2g（準(zhǔn)確至±0.02g）試樣于50mL離心管中，加入2mL水潤(rùn)濕，加入1%氨化乙腈10mL，渦旋混合1min，超聲提取10min，加入氯化鈉2g，渦旋混合1min，6000r/min離心8min，取上清液并轉(zhuǎn)移至20mL具塞刻度試管中，殘?jiān)?0mL1%氨化乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液，用乙腈定容至20mL，混勻，備用。8.2凈化8.2.1水HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇、5mL水活化。取水樣過(guò)柱，控制流速不超過(guò)5mL/min。待水樣全部通過(guò)小柱后，用10mL水淋洗，減壓抽干，用8mL甲醇洗脫。收集洗脫液，45℃下氮?dú)獯抵两?。?.00mL甲酸-乙腈溶液溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22μm尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。48.2.2底泥移取10.00mL上述備用液至50mL離心管中，加入無(wú)水硫酸鎂600mg,PSA吸附劑100mg，C18吸附劑40mg，渦旋振蕩1min，10000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至50mL茄形瓶中，45℃下減壓濃縮至近干，用2.00mL甲酸-乙腈溶液溶解殘?jiān)?，取上清液過(guò)0.22μm尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8.3底泥試樣含水率測(cè)定應(yīng)符合GB17378.5的要求。8.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用甲酸-乙腈溶液配制成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素濃度溶液的濃度均為50μg/L，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物特征離子質(zhì)量色譜峰峰面積比為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。8.5測(cè)定8.5.1液相色譜參考條件a)色譜柱：C18(100×2.1mm,粒徑2.6μm)，或相當(dāng)者；b)流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件見表1；d)流速：0.3mL/min；e)柱溫：40℃。表1流動(dòng)相梯度洗脫條件08.5.2質(zhì)譜參考條件a)離子源：電噴霧離子源；b)掃描方式：正離子掃描；c)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；5d)噴霧電壓：5.5kV；e)脫溶劑氣溫度：550℃;f)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量V8.5.3定性測(cè)定在相同測(cè)試條件下，試樣中待測(cè)物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，偏差在±2.5%以內(nèi)，且試樣中待測(cè)物定性離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。6表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差>50>20～50>10～208.5.4定量測(cè)定按8.5.1和8.5.2設(shè)定儀器條件，取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、試樣溶液、空白試樣溶液等體積進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液中目標(biāo)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖參見附錄B。8.6空白實(shí)驗(yàn)按照與上述測(cè)定步驟相同的條件進(jìn)行空白試樣（7.3）的測(cè)定。9結(jié)果計(jì)算和表述水中待測(cè)物含量按式（1）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果須扣除空白值，保留兩位有效數(shù)字。式中：X1——試樣中待測(cè)物的含量，單位為微克每升(μg/L）；Ci——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測(cè)物溶液濃度，單位為微克每升(μg/LV——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣體積，單位為毫升（mL）；底泥中待測(cè)物含量按式（2）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果須扣除空白值，保留兩位有效數(shù)字。式中：X2——試樣中待測(cè)物的含量，單位為微克每千克(μg/kgV1——試樣提取液體積，單位為毫升（mL）；V2準(zhǔn)確移取的備用液體積，單位為毫升（mL）；m試樣質(zhì)量，單位為克（gw試樣含水率，單位為質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。10檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度10.1靈敏度本方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體中8種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出限均為0.002μg/L，定量限均為0.005μg/L；在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境底泥中8種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出限均為0.5μg/kg，定量限均為1.0μg/kg。10.2準(zhǔn)確度7本方法水體在0.005μg/L～0.5μg/L添加濃度水平上的回收率為70%～120%；底泥在1μg/kg~100μg/kg添加濃度水平上的回收率為60%～120%。10.3精密度本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。8（資料性）8種大環(huán)內(nèi)酯類藥物中英文通用名稱、化學(xué)分子式和CAS號(hào)8種大環(huán)內(nèi)酯類藥物中英文通用名稱、化學(xué)分子式和CAS號(hào)見表A.1。表A.18種大環(huán)內(nèi)酯類藥物中英文通用名稱、化學(xué)分子式和CAS號(hào)中文通用名稱英文通用名稱化學(xué)分子式CAS號(hào)AnhydroerythromycinAC37H65NO1223893-13-2RoxithromycinC41H26N2O1580214-83-1ClarithromycinC38H69NO1381103-11-9OleandomycinC35H61NO123922-90-5KitasamycinC40H6