金針菇液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1金針菇液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了金針菇（Flammulinavelutiper）液體菌種生產(chǎn)基本要求、液體菌種制備、液體菌種質(zhì)量指標(biāo)、貯藏、記錄及存檔等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于金針菇液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.1壓力容器第1部分：通用要求GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB5749食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌術(shù)語GB/T37671食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)金針菇菌種NY/T528食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1731食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1搖瓶液體菌種liquidspawnculturingbyErlenmeyerflaskonashaker由母種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中在搖床上恒溫振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。3.2發(fā)酵罐液體菌種liquidspawnculturingbyfermentationtank由搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。3.3發(fā)酵罐fermentationbioreactor進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的專用設(shè)備，也稱發(fā)酵反應(yīng)器。3.4罐壓pressureoffermentationbioreactor食用菌液體菌種培養(yǎng)過程中培養(yǎng)器保持的空氣壓力，單位：Mpa。3.5通風(fēng)量ventilationvolume液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入培養(yǎng)基中的無菌空氣的量。用V/V（培養(yǎng)基體積/通入空氣體積）表示。23.63.7空消emptyfermentersterilization利用蒸汽對(duì)無物料的發(fā)酵罐及附屬設(shè)備進(jìn)行加熱滅菌的過程。實(shí)消intermittentsterilization將蒸汽通入裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行加熱滅菌的過程。4生產(chǎn)基本要求4.1工作人員具有食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)的專業(yè)技術(shù)人員和檢驗(yàn)人員。4.2場(chǎng)地菌種生產(chǎn)場(chǎng)地應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。環(huán)境衛(wèi)生應(yīng)符合NY/T1731的規(guī)定。4.3廠房生產(chǎn)廠房應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。4.4生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備設(shè)備與設(shè)施應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。液體種發(fā)酵罐質(zhì)量應(yīng)符合GB150.1的規(guī)定。4.5培養(yǎng)原料培養(yǎng)基原料應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。生產(chǎn)用水標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB5749要求。4.6生產(chǎn)品種選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、商品性好的金針菇品種，從具相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種或本單位選育，并能清楚地追溯菌種來源。菌種生產(chǎn)過程應(yīng)符合NY/T528的要求。5液體菌種制備5.1母種制備5.1.1培養(yǎng)基配方馬鈴薯（去皮煮汁）200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然。5.1.2菌種接種與培養(yǎng)母種活化操作流程應(yīng)符合NY/T528要求。將保存的母種切割成2mm～4mm接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度19℃~22℃,避光恒溫培養(yǎng)7d～9d，菌絲長(zhǎng)滿試管或者培養(yǎng)皿檢驗(yàn)合格即可使用?；罨竽阜N質(zhì)量應(yīng)符合GB/T37671要求。5.2搖瓶液體菌種制備5.2.1搖瓶液體菌種容器3使用1000mL的無色或近無色的玻璃三角瓶，用棉塞、硅膠塞、專用封口透氣膜封口。5.2.2培養(yǎng)基配方豆粕粉10g/L，蔗糖25g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，pH自然。5.2.3培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，混合均勻，裝入搖瓶中，裝液量為搖甁容量的50%～60%，搖瓶中放置磁力攪拌棒，封口。5.2.4滅菌將分裝好的搖瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，檢查鍋內(nèi)水位，立即滅菌。滅菌蒸汽壓力升至0.11MPa～0.12MPa，恒壓維持30min～40min。5.2.5接種待培養(yǎng)基冷卻至25℃以下，在無菌條件下，用打孔器打孔（5mm孔徑）或接種鉤?。?mm×5mm）4塊活化的母種菌塊迅速轉(zhuǎn)接于搖甁培養(yǎng)基內(nèi)，封口。5.2.6培養(yǎng)搖瓶接種后移至恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)溫度19℃~22℃,轉(zhuǎn)速150r/min，避光培養(yǎng)7d，菌種長(zhǎng)滿后置于1000r/min磁力攪拌器上攪拌10min。5.2.7搖瓶液體菌種質(zhì)量要求菌絲體白色、分布均勻；菌液澄清透明，無酸、臭、霉等異味，有金針菇特有的香味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常。5.3發(fā)酵罐液體菌種制備5.3.1容器使用耐126℃高溫的不銹鋼發(fā)酵罐。5.3.2發(fā)酵罐清洗5.3.2.1檢查罐上全部閥門、安全閥、壓力表等要求完好，工作正常。5.3.2.2清洗以流水無死角地清洗罐體內(nèi)外，達(dá)到內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物的潔凈程度。濾芯無油污、料污、無破損，外殼潔凈。5.3.3發(fā)酵罐空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長(zhǎng)期放置及更換品種時(shí)，應(yīng)進(jìn)行空消滅菌。蒸氣壓力0.11MPa～0.14MP，恒壓維持40min。5.3.4培養(yǎng)基配方4豆粕粉10g/L，蔗糖25g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，pH自然。5.3.5投料與定容用溫水將5.3.4配方中原料按比例攪拌均勻，加入罐內(nèi)，加水定容至罐體總?cè)莘e的70%～80%，然后加入0.01%～0.03%消泡劑，最后擰緊上料口蓋。5.3.6發(fā)酵罐實(shí)消液體種發(fā)酵罐內(nèi)蒸汽壓力控制在0.11MPa～0.12MPa，恒壓維持60min～90min。5.3.7冷卻滅菌結(jié)束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或者內(nèi)置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)，使培養(yǎng)基溫度降至22℃~24℃。當(dāng)罐體壓力表壓力降至0.05MPa時(shí)，打開氣泵以防止罐體在冷卻過程中產(chǎn)生負(fù)壓造成污染。5.3.8接種將發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，調(diào)小進(jìn)氣閥門，使發(fā)酵罐罐內(nèi)壓力為0.01MPa。點(diǎn)燃火焰圈，在火焰保護(hù)下用鑷子去掉瓶塞，打開接種口閥門，將搖瓶菌種勻速傾倒入發(fā)酵罐中，接種量為0.1%～0.2%，接種后迅速關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，繼續(xù)通入無菌空氣。5.3.9發(fā)酵培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長(zhǎng)情況，適時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥門，通入適量無菌空氣，通氣量一般為1：0.8V/V?min～1：1V/V?min，同時(shí)調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.01MPa～0.02MPa，培養(yǎng)溫度20℃~22℃,培養(yǎng)6d～7d。5.3.10檢測(cè)發(fā)酵后第4d開始定期檢測(cè)，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長(zhǎng)狀況和有無雜菌污染。6液體菌種質(zhì)量指標(biāo)6.1感官指標(biāo)應(yīng)符合表1的要求。表1金針菇液體菌種感官指標(biāo)菌液稍粘稠，有大量片狀、球狀菌絲體懸浮，固形物體積≥80有金針菇液體培養(yǎng)時(shí)特有的香氣，無酸、臭、霉、甜等異味，發(fā)6.2理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的要求。表2金針菇液體菌種理化指標(biāo)5無6.3液體菌種檢測(cè)方法6.3.1形態(tài)學(xué)觀察通過肉眼觀察菌球形態(tài)，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。6.3.2鎖狀聯(lián)合從檢驗(yàn)樣本中挑取菌絲少許，置于潔凈的載玻片上做成水封片，用不低于10×40的光學(xué)顯微鏡對(duì)水封片進(jìn)行觀察，每一檢樣應(yīng)觀察不少于50個(gè)視野。6.3.3霉菌檢驗(yàn)按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，置于28℃~30℃恒溫培養(yǎng)48h～72h，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長(zhǎng)狀況和有無霉菌污染，必要時(shí)進(jìn)行水封片鏡檢。6.3.4細(xì)菌檢驗(yàn)按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，置于28℃~30℃恒溫培養(yǎng)24h～48h，觀察是否有細(xì)菌污染，必要時(shí)進(jìn)行鏡檢和劃線培養(yǎng)檢驗(yàn)。6.3.5pH測(cè)定用pH計(jì)或pH試紙測(cè)定菌液酸堿度。6.3.6菌絲濕重測(cè)定稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)10000r/min離心5min，稱重。7貯存7.1標(biāo)簽生產(chǎn)的菌種必須貼有質(zhì)量合格標(biāo)簽，其內(nèi)容包含菌種種類、級(jí)別、品種、生產(chǎn)單位、接種日期。7.2貯存條件7.2.1母種保存母種在0℃~4℃條件下貯存，貯存期不超過60d。7.2.2搖瓶菌種保存搖瓶菌種生產(chǎn)好后，應(yīng)立即進(jìn)入菌種生產(chǎn)，若不能立即使用時(shí)，需降溫保存，暗光條件下4℃可保存5d～7d。7.2.3發(fā)酵罐液體菌種保存6發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)好后，