碩士研究生課現(xiàn)代生物技術(shù)概論劉柱

碩士研究生課現(xiàn)代生物技術(shù)概論劉柱載體的作用

1）將外源基因帶入受體細(xì)胞并保持穩(wěn)定2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3）為外源基因擴增或表達(dá)提供必要的條件克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。載體應(yīng)具備的條件

1）至少有一個克隆位點；2）至少有一個復(fù)制起點；3）必須含有標(biāo)記基因；4）安全的：不含有對受體細(xì)胞有害的基因；分子量小，拷貝數(shù)多，易分離等。質(zhì)粒載體（plasmid)噬菌體載體柯斯質(zhì)粒（cosmid)單鏈DNA噬菌體M13動、植物病毒克隆載體染色體克隆載體載體種類質(zhì)粒載體

質(zhì)粒載體的一般特征：它是一種裸露的比病毒更簡單，有自主復(fù)制能力的DNA分子，處于生命與非生命的的界線上。廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，在藍(lán)藻、霉菌、酵母甚至真菌細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒分子的存在。特點：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

質(zhì)粒的類型

1接合型質(zhì)粒----能自我轉(zhuǎn)移除自我復(fù)制外還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（F因子）

2非接合型質(zhì)粒----不能自我轉(zhuǎn)移

符合基因工程的安全要求。比如：R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）；Col質(zhì)粒質(zhì)粒的復(fù)制類型

1）嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）2）松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）質(zhì)粒載體的構(gòu)建

天然質(zhì)粒的局限性：1）分子量大，拷貝數(shù)低；2）篩選標(biāo)志不理想；3）減少限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點；4）質(zhì)粒安全性能的改造；5）改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。

人工質(zhì)粒的一般特征

a分子量盡量小

b載體分子上的基因位置，限制性內(nèi)切酶的作用位點甚至核苷酸序列為已知c載體易繁殖：松弛型拷貝

d具選擇標(biāo)記基因e應(yīng)最大限度的具有各種常用限制性內(nèi)切酶的單一切割位點

閱讀框架的選擇，防止移碼突變思考題：E.colibeta-D-galactosidaseLacZ：5-ATGACCATGATTACGGAT-3---------5-TGGTCTGGTGTCAAAAATAA

-3噬菌體載體

噬菌體的一般特性

噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）的總稱，簡稱phage。由遺傳物質(zhì)核酸和其外殼組成。結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。噬菌體的生活周期

噬菌體載體的分類

1)雙鏈?zhǔn)删w載體—

載體2)單鏈?zhǔn)删w載體M13

噬菌體的特點

1)長度為48502bp2)雙鏈線性DNA；3)在兩端有cos位點，可以環(huán)化。

噬菌體載體的構(gòu)建策略

1)刪除

噬菌體的非必需區(qū)，留識別位點作克隆位點2)在非必須區(qū)引進選擇標(biāo)記3)突變某些基因，使它成為安全載體4)刪除或甲基化必須區(qū)段上常用的限制酶切點，防止外源基因插入必須區(qū)！5）不小于36.4kb柯斯質(zhì)粒

1978年Collins和Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid（柯斯質(zhì)粒）。它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體λ的cos位點構(gòu)成。例如，柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構(gòu)成?？滤官|(zhì)粒特點

1）具λ噬菌體特點2）具有質(zhì)粒DNA的特性3）高容量的克隆能力，用于構(gòu)建基因組文庫4）具有與同源序列的質(zhì)粒重組的能力。①柯斯質(zhì)粒一般長4～6kb，是可以插入片段的1/10，易出現(xiàn)載體同載體自身連接。②容易錯配③柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體?？滤官|(zhì)粒作載體的缺點病毒克隆載體

構(gòu)建的基本策略：消除致病性，保留轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染特性。常用于植物轉(zhuǎn)化的病毒載體

Ti質(zhì)粒35S啟動子表達(dá)載體雙元表達(dá)載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建的原理是Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的轉(zhuǎn)移。

雙元表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個部分:一部分為輔助Ti質(zhì)粒，這類Ti質(zhì)粒由于缺失了T－DNA區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T－DNA的轉(zhuǎn)移。另一部份是微型Ti質(zhì)粒(Mini-Tiplasmid)，它在T－DNA左右邊界序列之間提供植株選擇標(biāo)記如NPTII基因以及LacZ基因等。含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。一般植物表達(dá)載體是成套使用的，一個是帶有可以供插入外源表達(dá)基因的MCS和篩選標(biāo)簽的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通載體。另一個載體就是雙元載體（binary-vector）。先將外源基因插入帶有篩選標(biāo)記的載體，然后將此載體上的35Spromoter-expressiongene-gfp這段全部切下，然后構(gòu)件亞克隆，其過程就是將上述的片斷插入雙元載體的LB和RB之間，其插入方