T-SHZSAQS 00215-2023 綿羊毛囊黑色素細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

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65.020.30學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載CCS

B

41 T/SHZSAQS

—2023綿羊毛囊黑色素細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程 石河子市質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) 發(fā)

布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00215—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12 規(guī)范性引用文件

....................................................................

13 術(shù)語(yǔ)和定義

........................................................................

14 工作區(qū)條件

........................................................................

15 主要儀器設(shè)備

......................................................................

16 主要試劑

..........................................................................

27 培養(yǎng)方法

..........................................................................

28 細(xì)胞免疫熒光鑒定

..................................................................

39 細(xì)胞凍存

..........................................................................

310

廢棄物處理

........................................................................

311

人員防護(hù)措施

......................................................................

3學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00215—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 本文件參照

GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件起草單位：新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：楊華、周華倩、樊文華、鄭晶晶、楊永林、余乾、張文喆。II兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00215—2023兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載1 范圍本文件規(guī)定了綿羊毛囊綿羊黑色素細(xì)胞體外培養(yǎng)的術(shù)語(yǔ)與定義及工作區(qū)條件、處理、人員防護(hù)措施等。適用于綿羊毛囊黑色素細(xì)胞體外培養(yǎng)。2 規(guī)范性引用文件適用于本文件。GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T31190 實(shí)驗(yàn)室廢棄化學(xué)品收集技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1

黑色素細(xì)胞并少量存在于毛囊中。3.2

胚胎期神經(jīng)外胚層與中胚層相互影響，發(fā)育形成多種細(xì)胞群組成的較完整結(jié)構(gòu)。4 工作區(qū)條件應(yīng)符合

GB19489

相關(guān)要求。5 主要儀器設(shè)備兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載篩網(wǎng)過(guò)濾消化液，

離心

5min

1×106/cm

的密度種植于

兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載篩網(wǎng)過(guò)濾消化液，

離心

5min

1×106/cm

的密度種植于

M-254

細(xì)胞培養(yǎng)CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)、冰箱、恒溫水浴箱、高壓滅菌器、干燥箱等。6 主要試劑6.1

如無(wú)特別說(shuō)明，所用試劑均為分析純。試驗(yàn)用水應(yīng)符合

GB/T6682

相關(guān)要求。6.2

無(wú)水乙醇、1×PBS、優(yōu)等胎牛血清、EDTA、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、M-254

培養(yǎng)基、HMGS

培養(yǎng)基、DMEM（high

glucose）培養(yǎng)基。7 培養(yǎng)方法7.1

樣品采集7.1.1

0.2cm×1cm

1×PBS中浸泡

5min，1×PBS

3

0.25%

于

37℃孵箱內(nèi)消化

。7.1.2

下脂肪組織，保留真皮組織。7.2

綿羊皮膚中毛囊組織的分離與純化真皮組織剪成0.2cm×0.2cm

℃消化30～60min，輕輕反復(fù)吹打直至吹散真皮組織，70μ

m

篩網(wǎng)過(guò)濾吹散真皮組織塊，1×PBS

沖洗

3次，收集毛囊組織，

5min，最后收集在管底沉淀的毛囊組織。7.3

綿羊毛囊黑色素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)7.3.1

向毛囊組織中加入

0.25%胰酶（含

0.02%EDTA

5min，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察毛囊組織周?chē)屑?xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，DMEM+10%胎牛血清終止消化，μ

m2基中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.3.2

24h

3

的

1×PBS

輕輕清洗

1

M-254

培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。7.3.3

當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至

～

0.02

%EDTA

的

0.05%胰蛋白酶的消化液，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，待一半細(xì)胞變圓時(shí)立即加入含

胎牛血清的

終止消化。7.3.4

1500rpm

5min，棄上清，M-254

培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以

1:3

的比例接種細(xì)胞。兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00215—2023兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載8 細(xì)胞免疫熒光鑒定8.1

毛囊黑色素細(xì)胞密度約

80～90%

洗

3

5min；將

4%多聚甲醛加入細(xì)胞培養(yǎng)板中使之充分接觸細(xì)胞，25

℃條件下固定

30min，吸棄全部液體，1×PBS

洗

3

次，每次

5min。8.2

用

0.3%

Triton

X-100

通透細(xì)胞

60min，1×PBS

清洗

3

次，每次

5min1%

封閉細(xì)胞中的非特異性抗原，25℃下

60min。8.3

MITF、、

和

蛋白的一抗

200μ

L

于

冰箱中過(guò)夜；次日吸棄全部一抗液體，用

1×PBS

洗

3

次，每次

5min。8.4

℃下避光孵育

60min

洗

3

次，每次

5min。8.5

避光下將

33342

10min；1×PBS

洗3

5min囊黑色素細(xì)胞。9 細(xì)胞凍存9.1

在細(xì)胞融合前，將細(xì)胞同培養(yǎng)液一起吸出，放入離心管中。9.2

1mL

5

次，1000r/min

5min，吸出含酶的上清懸液。9.3

將細(xì)胞用

1.5mL

培養(yǎng)液再次懸浮，

5min

1mL

凍存液重新懸浮細(xì)胞。加入適量?jī)龃嬉?/p>