昆蟲抗菌肽的分離純化技術標準團體標準

1昆蟲抗菌肽的分離純化技術標準本標準規(guī)定了昆蟲抗菌肽的分離純化技術要求，本標準以家蠅作為材料提純血淋巴的抗菌肽。本標準適用于以家蠅為材料的抗菌肽分離純化，對于其他昆蟲等作為材料純化抗菌肽可參照執(zhí)行。本規(guī)程規(guī)定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS電泳、抗菌肽活性測定方法等技術要求。本規(guī)程適用于抗菌肽的快速分離。2規(guī)范性引用文件用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）適用于本文件。GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》GB/T6682-2016《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》GB4789.2-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定3術語下列術語和定義適用于本文件：3.1抗菌肽（antimicrobialpeptides）抗菌肽（antimicrobialpeptide，AMPs）是一種基因編碼的、在體內誘導的、具有抗菌活性的堿性多肽物質，強堿性、熱穩(wěn)定性、對細菌、真菌、病毒等微生物與寄生蟲有抑殺活性。某些抗菌肽還具有抑殺腫瘤、中和內毒素、促進傷口愈合、調節(jié)免疫等多種生物學功能。3.2家蠅（Muscadomestica）在25℃,相對濕度60%～70%的實驗室內飼養(yǎng)家蠅，成蠅喂以白糖和奶粉，每日更換飲水。幼蟲以人工飼料（發(fā)酵麥麩）喂養(yǎng)。3.3多肽（polypeptides）介于氨基酸與蛋白質之間，有2個或2個以上氨基酸通過肽鍵連接形成的一類化合物。23.4多肽活力（antimicrobialactivity）抑制微生物的能力，以抑菌圈直徑（mm）來表示。3.5熱處理（HeatTreatment）抗菌肽是一種弱堿性物質，具有熱穩(wěn)定性、耐低溫的特性。將家蠅血淋巴于沸水浴中攪拌加熱3min后，迅速在冰浴中冷卻，10,000r.p.m/min離心20min，除去變性蛋白，沉淀再用等體積蒸餾水洗2次，以同樣轉速離心20min，合并3次上清液。3.6超濾膜（ultrafiltrationmembrane）膜超濾方法經常在分離純化的初期被用來進行蛋白質樣品的富集和粗級的分離。該方法的關鍵是選擇不同類型和規(guī)格的膜。3.7高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC）高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。4試劑或材料除非另有說明，本方法所用的試劑均為分析純，實驗用水GB/T6682規(guī)定的水。4.1生理鹽水0.85%生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉，用一級水溶解并定容至1000mL.121℃高壓滅菌20min。4.2培養(yǎng)基LB（Lucia-Bertani）液體培養(yǎng)基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，ddH2O定容至200mL，混勻，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，2g瓊脂粉，ddH2O定容至200mL，混勻，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。PDA（PotatoDextroseAgar）培養(yǎng)基：200g去皮土豆，于ddH2O中煮沸30min，紗布（8層）過濾固體殘渣，后加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，繼續(xù)煮沸至完全溶解，用一級水溶解并定容至1000mL，于高壓滅菌鍋120℃滅菌20min。4.3菌株革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（S.aureus）革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（E.coliK12D31）34.4Tricine-SDS-APGE49.5%T，3%C：48g丙烯酰胺，1.5g雙丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；49.5%T，6%C：46.5g丙烯酰胺，3g雙丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；電泳緩沖液：3.0MTris，0.3%SDS，pH8.25；陽極buffer：200mMTris，pH8.9；陰極buffer：100mMTricine，100mMTris，0.1%SDS，pH8.25；Loadingbuffer(2×)：3ml3MTris(pH8.25)，3mL80%甘油，0.8gSDS；1.5mg考馬斯亮藍R-250，0.5mg苯酚紅，加ddH2O定容至10ml；3MTris緩沖液(pH8.45)，36.3gTris堿，溶于80mLddH2O，用濃HCl調pH至8.45，定容至100mL。5儀器設備恒溫培養(yǎng)箱：溫度精度1℃電子天平：感溫為0.0001g和0.01g酶標儀（Bio-rad公司)：波長范圍190nm~900nm抑菌圈測量儀：精度0.02mm~0.1mm血球計數(shù)板：16格×25格或25格×16格玻璃器皿：直徑為90mm，底部平整Bio-rad垂直電泳儀器高效液相色譜儀(P680四元梯度泵、ASI-100自動進樣器、PDA-100檢測器及Chromleon6.4工作站)KromasilC18色譜柱（250×4.6mm，5um，300A）。6實驗步驟6.1家蠅飼養(yǎng)在25℃,相對濕度60%～70%的實驗室內飼養(yǎng)家蠅，成蠅喂以白糖和奶粉,每日更換飲水。幼蟲以人工飼料（發(fā)酵麥麩）喂養(yǎng)。6.2家蠅抗菌肽的誘導家蠅3齡幼蟲經0.85%生理鹽水洗滌，75%酒精消毒后，用微量注射器注射對數(shù)生長期的E.coliK12D31（濃度約為108個/mL）2μL/每頭，在高溫消毒的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)。46.3家蠅三齡幼蟲血淋巴的提取及檢測每次約20g三齡幼蟲，放入到預冷的研缽中，加入0.05M乙酸銨緩沖液5mL，并加入少許(0.1g)苯基硫脲，把蟲體剪碎、勻漿，用雙層紗布過濾，取濾液在10,000r.p.m/min離心20min，上清液通過紗布除去少量脂肪。再用5mL緩沖液沖洗殘渣，混勻，再用10,000r.p.m/min離心20min，取上清。然后合并2次上清，置于-80℃保存?zhèn)溆?參考附錄A)。6.4熱變性將上述方法所得血淋巴于沸水浴中攪拌加熱10min后，迅速在冰浴中冷卻，12,000r.p.m/min離心20min，除去變性蛋白，沉淀再用等體積蒸餾水洗2次，以同樣轉速離心20min，合并3次上清液。6.5超濾膜上清分別用截留10kDa的超濾離心柱10,000g超濾離心10min，收集濾過部分，然后用截留3kDa的超濾離心柱10,000g超濾離心10min，棄濾過部分，收集未濾過部分。Bradford法檢測10kDa超濾樣品的蛋白濃度，超濾前水解原液濃度為1.12mg/ml，超濾后截留液濃度為1.85mg/ml，濾過液濃度為0.48mg/ml，表明上層樣品得到了濃縮，小分子蛋白、無機鹽和水等在離心壓力下穿過小孔徑的濾膜，進入到超濾裝置的下層(參考附錄D)。6.6蛋白濃度的測定取10mg牛血清白蛋白，用ddH2O溶解并定容到100mL，其終濃度為100μg/mL。稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶解至50mL95%的乙醇中，加85%的磷酸100mL，用ddH2O定容至1000mL。按照附錄B配制標準曲線溶液(參考附錄B)。6.7HPLC經超濾收集到的液體用0.1M的乙酸鈉透析過夜，直接上樣預先經乙酸鈉（pH5.0，0.1M）平衡的CM-SepharoseCL-6B柱，然后以150mL平衡液對150mL，pH5.01M的乙酸鈉緩沖液作梯度展開，梯度結束后，再用300mL，1MNaAc（pH5.0）洗脫，流速為0.2mL/min，每1min收集一管，收集合并各活性峰，收集的蛋白冷凍干燥，-80℃保存(參考附錄C)。6.8Tricine電泳檢測(Tricine-SDS)制膠采用Bio-rad垂直電泳附件模具，制成0.75mm厚凝膠，分離膠分別制成20%T，6%C和15%T，3%C的梯度膠，堆積膠為8%T，3%C。恒電壓60v，1h后90v跑至膠盡頭。電泳完畢，膠置于0.25%考馬斯亮藍R250的甲醇∶水∶冰乙酸(5∶5∶1)染色液過夜。膠置含12.5%異丙醇10%醋酸中擴散脫色直至背景清晰。并利用CN-UV/WLImage-FormationSystem的Bioplot軟件對目的蛋白進行分析，測定該蛋白在總蛋白中的含量，即為其表達率(參考附錄D)。56.9平板打孔穴抑菌法6.9.1菌液活化分別挑取平板上的E.coliK12D31和S.aureus單菌落接種于2mLLB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)。取此培養(yǎng)液按1/100體積接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.3。6.9.2指示菌液制備按照GB4789.2進行指示菌的菌落計數(shù)。建立菌落計數(shù)與OD600的關系，調整至菌落數(shù)為5~1*106CFU/mL6.9.3制備平板取LB固體培養(yǎng)基約20ml，加熱融化后冷卻至45℃左右，加入60μl的工程細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，OD600=0.3)，搖勻，倒入9厘米玻璃培養(yǎng)皿。6.9.4測定用一打孔器(孔徑約3mm)沾取酒精經火焰滅菌3次，在已含菌的平板上打孔，每孔加樣20μl純化的小肽，點樣后的平皿放入5℃冰箱培養(yǎng)12h讓抗菌肽充分擴散到瓊脂中以得到更大的抑菌效果，同時還可以抑制周圍污染菌的生長；然后將平皿放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后觀察結果，在加有抗菌活性的抗菌肽周圍可形成一個清晰的圈，抑菌圈直徑為實際抑菌圈減孔直徑。抑菌試驗判定標準:抑菌圈直徑等于0mm為不敏，抑菌圈直徑≤5mm為低敏，抑菌圈直徑等于5~7mm為低度敏感，抑菌圈直徑等于7~11mm為中度敏感，抑菌圈直徑≥11mm為高度敏感(參考附錄E)。6（資料性附錄）家蠅血淋巴的的Tricine-SDS（資料性附錄）配制標準曲線溶液體系取0.1mL待測樣品用ddH2O稀釋10倍后，加入5mL配好的考馬斯亮藍染色液，測其A595。溶液（mL）編號012345牛血清白蛋白00.8ddH2O0.20考馬斯亮藍5.05.05.05.05.05.08（資料性附錄）家蠅三齡幼蟲血淋巴的HPLC分析9（資料性附錄）kDa97.466.24331MS1U1M