數(shù)字PCR可行性分析

數(shù)字PCR可行性分析數(shù)字PCR技術(shù)的原理數(shù)字PCR〔DigitalPCR-dPCR〕技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR〔qPCR〕技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”〔divideandconquer〕［1］，這種做法非常類似于計算機科學(xué)中的“分治算法”，將一個標準PCR反響分配到大量微小的反響器中，在每個反響器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結(jié)束后，通過陽性反響器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反響器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。圖1.數(shù)字PCR的原理數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反響受擴增效率的影響大大降低，對PCR反響抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反響體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。數(shù)字PCR技術(shù)的開展歷史從原理可以看出，數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺根底——聚合酶鏈式反響和雙鏈DNA標記技術(shù)，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法，dPCR和qPCR并沒有實驗方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個角度來說，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術(shù)并不準確。在實時定量PCR技術(shù)成熟和開展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法〔

limitingdilution,PCRandPoissonstatistics〕，檢測了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究［2］，雖然當時這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR根本的實驗流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原那么——以“終點信號的有或無”〔all-or-noneendpoint

〕作為判斷標志，這也是之后1999年BertVogelstein和KenKinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digitalPCR)的主要原因［3］。數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單，然而在樣品分散〔divide〕的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反響的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,Magnetics)，2006年Fluidigm公司推出了第一臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國Inostics

推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMingdPCR檢測效勞，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法到達更加精細的要求，時間和耗材本錢嚴重限制了dPCR技術(shù)的開展。近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)〔nanofabricationandmicrofluidics〕的開展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最正確契機。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國專利，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術(shù)顯露雛形［4］。伴隨二代測序技術(shù)開展起來的“油包水PCR”技術(shù)，可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。QuantaLife

利用油包水微滴生成技術(shù)開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，這也是最早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺，在運行本錢和實驗結(jié)果穩(wěn)定性方面都根本到達了商品化的標準。2011年，QuantaLife

公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售，這個早期型號為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設(shè)備，這個設(shè)備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺，在高壓氣體驅(qū)動下，將每個標準反響體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反響乳液，該公司的創(chuàng)始人之一DarrenLink表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”［1］。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，這也是目前數(shù)字PCR市場上最新型號的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個單獨的反響孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設(shè)計防止了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題［5］。數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域從上世紀90年代以來qPCR技術(shù)的爆發(fā)式開展使得現(xiàn)代核酸檢測技術(shù)具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。本錢更低的DNA測序技術(shù)正在迅速開展，也是目前競爭最為劇烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭取到屬于自己的一席之地。癌癥診斷檢測研究說明，腫瘤可能通過細胞壞死及凋亡從而釋放大量的基因組DNA進入人體系統(tǒng)循環(huán)，因此可以通過這些DNA分子的微衛(wèi)星DNA變化、易位、突變和甲基化等對癌癥進行檢測。近年來，數(shù)字PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用到血液、糞便等非侵入性樣本分析中，為癌癥的檢測提供新的途徑。

表皮生長因子受體(epidermal

growth

factor

receptor,

EGFR)屬于酪氨酸激酶受體，它介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖和分化，大量研究說明，EGFR基因的突變或過表達會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。Yung等[6]利用數(shù)字PCR技術(shù)研究非小細胞性肺癌病人血漿和腫瘤中第19外顯子框內(nèi)缺失和第21外顯子L858R突變兩種ERFR突變體，通過微流體系統(tǒng)對35份血漿樣本進行檢測，兩種突變類型檢出率分別為17%和26%，該結(jié)果與對腫瘤樣本的測序相比，其靈敏度和特異性分別到達92%與100%。隨后，Wang等[7]也將數(shù)字PCR檢測應(yīng)用到肺癌基因組中EGFR異常的檢測中，得出了相同的結(jié)論，即數(shù)字PCR能夠?qū)GFR突變具有靈敏的檢測與精確的定量，適用于肺癌的診斷，對預(yù)測治療反響、監(jiān)測病情進程及早期抗藥性診斷等提供了非常有利的分析手段。

在對結(jié)腸癌的研究中，Taly等[8]采集19位病人的血液樣本，通過數(shù)字PCR分析結(jié)果顯示其中14例樣本檢測到KRAS基因突變，1例檢出與腫瘤樣本不一致的突變，另外5例那么檢測不到，同時其中5例BRAF

V600E突變型全部檢測出來。Qi等[9]那么利用數(shù)字PCR對直腸癌病人的糞便樣本進行mRNA定量分析，在8例病人組織和9例糞便樣本中的檢出率分別達100%和77%。產(chǎn)前診斷〔prenatal

diagnosis〕

產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是指胎兒出生前采用遺傳學(xué)和影像學(xué)等各種檢測方法預(yù)測其是否有先天性疾病，是預(yù)防染色體病患兒出生的主要措施。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷采用侵入性診斷〔invasive

prenatal

diagnosis〕方法，主要包括孕中期的胎兒羊水的產(chǎn)前診斷、臍血的產(chǎn)前診斷，目前常用的取材手術(shù)主要有絨毛膜絨毛取樣，羊膜腔穿刺，臍帶血穿刺等，但這些方法對母體和胎兒均有一定的創(chuàng)傷并存在胎兒喪失風險。而非侵入性產(chǎn)前診斷(non-invasive

prenatal

diagnosis,

NIPD)那么采用了無創(chuàng)傷的技術(shù)方法防止了以上的平安威脅，成為當下引起廣泛關(guān)注的診斷方法。1997年，Lo等采集孕婦血液進行研究，利用PCR的方法擴增Y染色體特異片段并出現(xiàn)陽性信號，證明母體血液中存在胎兒的DNA[10]，自此拉開了NIPD研究的序幕。但是，從大量母體DNA中成功檢測到胎兒游離DNA的過程中存在相當大的難度，需要提高檢測方法的靈敏度和特異性。2007年，Lo等利用數(shù)字PCR技術(shù)開展了兩種策略用于產(chǎn)前診斷胎兒21三體綜合癥，其一稱之為digital

RNA-SNP，檢測胎盤細胞特異表達即完全來自胎兒的21號染色體上PLAC4

mRNA的SNP位點的比例；其二為digital

RCD法，檢測孕婦血液中21號染色體與1號染色體的相對含量，可以檢測到血液中25%的胎兒基因[11]。Lun等[12]比擬了數(shù)字PCR與實時定量PCR、質(zhì)譜檢測三者的靈敏度，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR比其他兩種方法更為精確，因此，數(shù)字PCR檢測到胎兒基因的濃度可能要高于預(yù)期。隨著研究的深入，數(shù)字PCR被證明比傳統(tǒng)技術(shù)方法具有更高的臨床靈敏度和特異性，未來該技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域?qū)⒃絹碓奖粡V泛地應(yīng)用。

稀有突變分析在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP〔SingleNucleotidePolymorphism，單核苷酸多態(tài)性〕檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反響嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在癌癥標志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。稀有突變檢測對癌癥研究具有重大意義。原癌基因或腫瘤抑癌基因的突變累積是促進腫瘤發(fā)生的一個重要因素。極少量體細胞的上述突變即足以促進癌癥發(fā)生或開展。由于上述突變通常只存在于極少量的細胞中，因此需要使用具有高信噪比和低假陽性率的Assay。常用的SNP基因分型技術(shù)(如毛細管電泳或?qū)崟r熒光定量PCR)是最高效的突變檢測方法，可以檢測突變率不低于20%(約五分之一細胞)的突變細胞。但是，數(shù)字PCR能夠從野生型背景中鑒別出突變基因，具有更高的靈敏度和精度。數(shù)字PCR通過將樣本分到芯片的數(shù)千個單獨的PCR反響中，大大降低了某個反響中的總分子數(shù)，從而有效地富集目標序列，并稀釋了野生型背景。拷貝數(shù)變異〔CNV〕鑒定拷貝數(shù)變異(CNV)是基因座的野生型拷貝數(shù)相比參考基因組增加或減少造成的基因組失衡。這些基因組改變從小的(小于10kb)插入或缺失到大的(超過1Mb)、復(fù)雜的多等位基因復(fù)制均有。CNV是人類基因組中最常見的遺傳變異，與多種疾病有關(guān)，包括癌癥或遺傳性疾病易感性[13,14]。因此，我們需要簡單可靠的方法定量CNV，用作潛在的生物標記物，并用于了解腫瘤形成的分子機制。目前的CNV評估方法如表1所示。這些方法包括原位雜交，但該方法耗時、費力且結(jié)果分析具有主觀性[15]。陣列比擬基因組雜交(aCGH)可以提供更高的精度，但該方法需要大量的操作時間且分辨率取決于所需的陣列類型[16]。最近，下一代測序技術(shù)的進步使得通過單次運行即可經(jīng)濟高效地檢測多種類型的遺傳變異成為可能[17]。最后，在目前所有方法中，實時熒光定量和數(shù)字PCR技術(shù)提供了最簡單的工作流程，可以獲得準確的拷貝數(shù)結(jié)果，且操作時間極短，周轉(zhuǎn)時間較快。

HER2(人表皮生長因子2，又稱為ERBB2)是一種原癌基因，在特定的情況下會促進癌癥細胞的增殖。原癌基因促進腫瘤發(fā)生的機制有三種：(1)染色體重排導(dǎo)致超活性基因融合，(2)編碼序列上的點突變或缺失導(dǎo)致超活性蛋白生成，(3)基因擴增導(dǎo)致蛋白質(zhì)過表達。HER2基因擴增多年來一直被視作早期乳腺癌預(yù)后不佳的指標之一，亦是選擇早期和晚期癌癥最正確治療方案的關(guān)鍵因素(例如，使用赫賽汀[Herceptin?]進行HER2蛋白靶向治療)目前，原位熒光雜交(FISH)和銀染原位雜交(SISH)是用于預(yù)后情況和藥物有效性評估的常規(guī)方法。但是上述方法存在諸多缺點，包括冗長繁瑣的染色和切片制備過程、需要專業(yè)的技術(shù)培訓(xùn)、檢測本錢較高。同時傳統(tǒng)方法在某些具有挑戰(zhàn)性的情況下進行結(jié)果判斷時會引入一定程度的主觀因素?；始宜_里郡醫(yī)院致力于探索采用數(shù)字PCR(dPCR)作為SISH的替代方法用于HER2拷貝數(shù)檢測，以改善技術(shù)和本錢。數(shù)字PCR將樣本模板分散到眾多單獨的PCR反響器中，其中一局部反響器含有目標分子(已擴增)，另一局部那么不含有目標分子(未擴增，稱為陰性)。PCR擴增后，利用陰性反響局部計算樣本中目標分子的絕對數(shù)量，無需參照標準品，可實現(xiàn)對目標DNA分子的絕對定量。因此，相比目前用于評估HER2基因擴增的SISH方法，該技術(shù)能夠降低主觀性，提升標準化水平，而且可節(jié)省超過75%的本錢。MicroRNA前體定量越來越多的證據(jù)說明，microRNA是參與幾乎所有生物學(xué)過程的根本元件。成熟microRNA可介導(dǎo)microRNA依賴性的基因沉默。盡管microRNA前體是microRNA生物發(fā)生和加工的根底，但現(xiàn)有的大多數(shù)檢測方法仍致力于成熟microRNA的檢測，針對microRNA前體的檢測卻很少。microRNA前體檢測面臨的挑戰(zhàn)主要歸因于其較低的豐度、必須使用參照轉(zhuǎn)錄本，以及序列相似性造成的干擾。LifeTechnologies開發(fā)的基于硅芯片的QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以大大提升mir-9初級前體轉(zhuǎn)錄本檢測的精確度。檢測原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中同一microRNA的3個不同的前體-miR-9(pri-miR-9-1、-2和-3)，結(jié)果顯示，采用QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以輕松克服傳統(tǒng)microRNA前體檢測方法面臨的挑戰(zhàn)。研究證明短期和長期酒精暴露，可以觸發(fā)培養(yǎng)細胞中miR-9前體的變化。檢測可重復(fù)性極高，精度范圍為1.26-2.33%。其中一種miR-9前體嵌于蛋白質(zhì)編碼的mRNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)，而其他兩種前體那么是長的非編碼轉(zhuǎn)錄本，這些結(jié)果說明了數(shù)字PCR(dPCR)方法的通用性。數(shù)字PCR的市場前景數(shù)字PCR是近年來迅速開展起來的一種定量分析技術(shù)。迄今為止,已有Fluidigm、Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字PCR產(chǎn)品,這些產(chǎn)品已經(jīng)在單細胞分析、癌癥早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域顯示出巨大的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用前景。根據(jù)全球知名咨詢公司Frost&Sullivan的研究分析師KarolinaOlszewska表示：“dPCR的高靈敏度讓它成為多個應(yīng)用的理想選擇，包括拷貝數(shù)變異、稀有突變檢測以及核酸序列的絕對定量。數(shù)字PCR因其精確性、重復(fù)性以及在診斷和制藥應(yīng)用上的潛力而引起了行業(yè)的極大關(guān)注。在這一高速增長、前景廣闊的市場，Bio-Rad在數(shù)字PCR上的投資是富有成效的?！睋?jù)Frost&Sullivan預(yù)計，2011-2016年間數(shù)字PCR儀器市場將以52%的年均復(fù)合增長率增長。Frost&Sullivan發(fā)布的美國qPCR和dPCR儀器市場的分析報告指出，美國的實時定量PCR和數(shù)字PCR儀器市場正處在不同的增長階段，但兩者都保持競爭活力。盡管qPCR市場很成熟，但其競爭力正在擴張，因為幾個大牌的生命科學(xué)公司進入此市場，希望擴展它們的基因組學(xué)流程方案。同時，新興的dPCR市場也在快速增長，早期采用者增加，而供給商也在擴展技術(shù)應(yīng)用，以拓寬應(yīng)用范圍。dPCR作為一項新技術(shù)，儀器定價仍然較高，讓很多實驗室望而卻步。dPCR目前的客戶僅限于制藥和生物技術(shù)公司，以及一些資金充裕的大型科研實驗室。據(jù)DeciBio預(yù)計,2016年生命科學(xué)儀器市場預(yù)計$458億,中國是最強驅(qū)動力。一個高增長的技術(shù)領(lǐng)域是數(shù)字PCR，該技術(shù)的復(fù)合增長率將飆升至90%，從2011年1000萬美元升至2016年2.5億美元。數(shù)字PCR的操作步驟2013年下半年，Life-technologies推出的QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)采用最簡單的工作流程，只需極少的手工操作步驟和極短的操作時間。該系統(tǒng)的核心是一塊包括20000個反響孔的硅芯片，每塊芯片運行一個樣本，在一次實驗中可同時分析兩個靶點。每個QuantStudio3D芯片試劑盒包括12塊芯片及蓋子、12個上樣刮板和3個浸液注射器及針頭。PCR預(yù)混液的制備與實時熒光定量PCR反響相同，將TaqManAssay、DNA或cDNA樣本以及預(yù)混液參加一支試管內(nèi)混勻〔步驟1〕。此外，QuantStudio3D芯片是獨立包裝的一次性耗材，可最大程度降低樣本受到污染的危險。上樣刮片也是一次性使用，簡化了芯片上樣過程。制備好反響混合物后，使用自動芯片加載系統(tǒng)上樣，翻開加載系統(tǒng)，將翻開的芯片放置于上樣底座上〔步驟2〕；將上樣刮片置于加載系統(tǒng)臂的固定裝置上〔步驟3〕；將芯片蓋子放置于儀器轉(zhuǎn)臂的固定裝置上〔步驟4〕；將反響混合物加至上樣刮片〔步驟5〕；按下按鈕，分配器自動將反響混合物分配至芯片的20000個反響孔內(nèi)〔步驟6〕，然后密封芯片〔步驟7〕〔芯片密封劑可以在紫外光下發(fā)生固化，密封劑經(jīng)自動上樣設(shè)備上的紫外裝置激活，對芯片進行密封〕；密封后可以在帶有雙平板模塊的熱循環(huán)儀上對芯片進行擴增，在熱循環(huán)儀上進行擴增需要約2個半小時〔步驟8〕；QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)一次讀取一塊芯片〔步驟9〕，需要30秒完成讀數(shù)〔在芯片讀取過程中，儀器讀取芯片唯一的標識符，捕獲擴增樣本的熒光信號，芯片讀數(shù)中會捕獲所有反響孔的ROX、FAM和VIC通道熒光圖像，數(shù)據(jù)輸出為FAM和VIC通道的計數(shù)〔拷貝數(shù)/微升〕；通過ROX信號確認反響孔中是否存在樣本〕；最后，將數(shù)據(jù)寫至用戶定義的目標位置——儀器、USB驅(qū)動器、聯(lián)網(wǎng)效勞器等，使用QuantStudio?3DAnalysisSuiteTM現(xiàn)有的軟件模塊，可以對實驗結(jié)果進行進一步的數(shù)據(jù)和圖像分析。步驟1步驟2步驟3步驟4步驟5步驟6步驟7-1步驟7-2步驟8-1步驟8-2步驟8-3步驟9Fluidigm公司2006年底推出的Bio-Mark?基因分析系統(tǒng)由Bio-Mark?實時PCR系統(tǒng)〔整合了高性能計算機〕、IFC微液流芯片〔耗材〕、IFCController〔將生物樣品、反響試劑導(dǎo)入到IFC微液流芯片中〕和數(shù)據(jù)分析軟件四局部構(gòu)成。IFC微液流芯片有2種：DynamicArray〔48.48動態(tài)芯片和96.96動態(tài)芯片〕和DigitalArray〔12.765數(shù)字芯片和48.770數(shù)字芯片〕。數(shù)字芯片將預(yù)混液〔樣品與PCR試劑〕分成數(shù)百個單獨的PCR反響，開展數(shù)字PCR分析。整個過程分為五步：準備芯片；將每個樣品預(yù)混液移液至芯片的獨立入口；將芯片放入IFCController，利用軟件界面迫使分析組分進入單獨的反響板；將芯片放入BioMark系統(tǒng)，開展熱循環(huán)和熒光檢測；利用分析軟件來查看和分析擴增曲線。與上面兩者相比，浙大的SPC芯片系統(tǒng)〔圖2〕采用自吸式分液進樣芯片，進樣方法簡便，無需外源動力。ZJU自吸式分液進樣芯片既是耗材又有自動分配反響液的功能。相當于簡化了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)的步驟2-步驟7，也無需像Fluidigm公司一樣利用IFCController儀器進樣。圖2ZJU自吸式分液進樣芯片本錢分析數(shù)字PCR的流程比傳統(tǒng)的qPCR更簡單，但通量較低，根本每塊芯片上千個反響單元都是針對單一樣本的分析，而熒光檢測技術(shù)的局限性限制了多個芯片的同時檢測。結(jié)論生物學(xué)的根底研究和分子技術(shù)的前進伴隨著更精確和更靈敏的測量技術(shù)開展。dPCR具有測量獨立性與無需任何校準物的特點。因此，該技術(shù)是潛在的核酸測量基準方法，并從原理上為核酸計量提供了保證[19]。相比其他方法，dPCR作為絕對定量方法能準確定量目標DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)[4]。商業(yè)化dPCR儀器(如Fluidigm公司的BioMarkSystem)的大量出現(xiàn)進一步推動和擴大了該技術(shù)的開展和應(yīng)用范圍。參考文獻：MBaker.(2012).DigitalPCRhitsitsstride.Naturemethods,9(6):541-544.SykesPJ,NeohSH,BriscoMJ,HughesE,CondonJ,MorleyAA.(1992).QuantitationoftargetsforPCRbyuseoflimitingdilution.Biotechniques,13(3):444-449.Vogelstein,B.&Kinzler,K.W.(1999).DigitalPCR.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(16):9236-9241.Kalinina,O;BrownJ,SilverJ(1997).

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