非小細(xì)胞肺癌基因檢測培訓(xùn)課件

非小細(xì)胞肺癌基因檢測前言隨著分子醫(yī)學(xué)進(jìn)展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療已進(jìn)入到個體化治療的時代。目前臨床應(yīng)用的個體化靶向治療主要針對EGFR突變型和ALK融合基因型肺癌,這兩種基因變異型肺癌均具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測技術(shù)及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。2非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR突變檢測中需要明確的幾個基本概念2、基因突變是指DNA發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對性的檢測手段，針對非DNA的檢測手段如：RT-PCR（檢測RNA表達(dá)），免疫組化（檢測蛋白表達(dá)）以及針對非堿基序列的檢測手段如：FISH（檢測DNA的擴(kuò)增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。體細(xì)胞突變發(fā)生在非種系組織中不具有遺傳性不會遺傳給子代種系突變發(fā)生于精子或卵子中可以遺傳子代子代所有細(xì)胞均帶突變1、EGFR突變?yōu)轶w細(xì)胞突變：發(fā)生于腫瘤細(xì)胞中，正常細(xì)胞（癌旁或白細(xì)胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，這是保證檢測結(jié)果可靠的根本前提。3非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR基因突變檢測概念EGFR突變檢測指腫瘤組織中編碼EGFR基因的DNA突變狀態(tài)檢測并不是：EGFR基因DNA拷貝數(shù)的檢測（FISH法）EGFR蛋白表達(dá)量的檢測（IHC法）。EGFR檢測檢測物質(zhì)部位方法基因突變DNA細(xì)胞核測序法、ARMS法等拷貝數(shù)DNA細(xì)胞核熒光原位雜交法（FISH）蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)細(xì)胞膜免疫組化法（IHC）RNA表達(dá)RNA細(xì)胞核RT-PCRX4非小細(xì)胞肺癌基因檢測NatureReview2007,7:169NSCLC中EGFR酪氨酸激酶區(qū)突變種類5非小細(xì)胞肺癌基因檢測6非小細(xì)胞肺癌基因檢測標(biāo)本采集及病理評估DNA抽提及質(zhì)控檢測報告EGFR突變檢測ARMS測序法其它方法EGFR突變檢測流程7非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR突變檢測中的相關(guān)角色患者臨床醫(yī)生胸外科醫(yī)師內(nèi)鏡醫(yī)師收集肺癌組織標(biāo)本病理科醫(yī)生準(zhǔn)備樣本實驗操作及結(jié)果分析實驗室人員報告結(jié)果給臨床醫(yī)生腫瘤科醫(yī)生放療科醫(yī)生呼吸科醫(yī)生8非小細(xì)胞肺癌基因檢測用于EGFR突變檢測的標(biāo)本腫瘤組織—目前最可靠的標(biāo)本；其它樣本：外周血（血漿、血清）細(xì)胞學(xué)（胸水、痰液細(xì)胞學(xué)）支氣管刮取物

仍需進(jìn)一步研究確定這些樣本在臨床實踐及診斷中的應(yīng)用9非小細(xì)胞肺癌基因檢測標(biāo)本問題石蠟組織：盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標(biāo)本。石蠟切片：含腫瘤細(xì)胞越多越好（50%以上）；組織部位面積約6mmx6mm以上；包埋組織：組織塊不小于0.5×0.5×0.5（cm）。

新鮮組織：比石蠟等處理過的舊組織，DNA保存得更完整，對PCR實驗更有利，但一定要經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)。含有腫瘤組織50%以上；重量≥10ｍg（約米粒大小以上），經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈。取癌組織的中心位置組織塊（避開壞死區(qū)域），固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：可用原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶：只要能獲得足夠的癌細(xì)胞，均可；但對于復(fù)發(fā)的患者，再次活檢不僅可確診，還可以獲得分子標(biāo)志物的進(jìn)一步信息。10非小細(xì)胞肺癌基因檢測標(biāo)本因素對EGFR突變檢測的影響--腫瘤組織特點(diǎn)--遺傳異質(zhì)性

對檢測方法敏感度有較高要求正常細(xì)胞混雜11非小細(xì)胞肺癌基因檢測標(biāo)本因素對EGFR突變檢測的影響--組織標(biāo)本種類--

對檢測方法有相應(yīng)要求，組織標(biāo)本及DNA質(zhì)控尤其重要

冰凍新鮮組織

固定包埋組織--外科手術(shù)標(biāo)本

完整，量多

廣泛--小活檢標(biāo)本

完整，量少

受限--外科手術(shù)標(biāo)本

片段化，量多

受限--小活檢標(biāo)本

片段化，量少

極度受限D(zhuǎn)NA質(zhì)與量

適用方法12非小細(xì)胞肺癌基因檢測圖4.EGFR基因檢測使用的臨床樣本及其操作。A.被切成10微米的石蠟包埋標(biāo)本。B.在支氣管鏡下將刷檢樣本放在生理鹽水中洗凈（懸?。?，可以就這樣冷凍保存，C.進(jìn)一步將該生理鹽水液離心，沉淀溶解于AL緩沖液，此狀態(tài)可以室溫保存。13非小細(xì)胞肺癌基因檢測檢測方法目前EGFR基因突變的檢測方法很多DNA直接測序法應(yīng)用廣泛，可檢測已知的突變和未知的突變，但對標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞含量要求較高，一般要求標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的比例在50%以上，至少不低于30%?；趯崟r熒光定量PCR基礎(chǔ)上的方法（如ARMS法）較直接測序法更加敏感，可檢測樣品中1.0%~0.1%的突變基因，更適合用于腫瘤細(xì)胞含量較少的小標(biāo)本檢測。ARMS方法操作簡單，是目前臨床上較常用的方法之一，但只能檢測已知的突變，且標(biāo)本需進(jìn)行預(yù)處理，檢測費(fèi)用較高。15非小細(xì)胞肺癌基因檢測直接測序法流程及數(shù)據(jù)分析PCR**純化測序反應(yīng)測序儀毛細(xì)管電泳純化數(shù)據(jù)分析EGFRdeletionEGFRL858R電泳質(zhì)控組織標(biāo)本DNA**PCR是關(guān)鍵：--特異性--產(chǎn)物長度--必要時巢式--建議通用測序引物16非小細(xì)胞肺癌基因檢測DNAARMS反應(yīng)實時定量PCRARMS法操作流程及數(shù)據(jù)解讀數(shù)據(jù)分析內(nèi)參信號(HEX)突變信號:

+

-內(nèi)參信號:

+ +標(biāo)本＃1（突變陽性）標(biāo)本＃2（突變陰性）突變信號(FAM)組織標(biāo)本內(nèi)參信號(HEX)17非小細(xì)胞肺癌基因檢測測序法與ARMS法比較測序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE標(biāo)本成功率低高檢測流程復(fù)雜慢長簡單快速數(shù)據(jù)分析要求高低假陽性機(jī)會(交叉污染)多少假陰性機(jī)會多少儀器成本高低商用試劑盒無有試劑成本低略高18非小細(xì)胞肺癌基因檢測小結(jié)：了解你的標(biāo)本 --新鮮/冰凍組織>FFPE組織 --手術(shù)標(biāo)本>小活檢標(biāo)本選擇合適的方法

--ARMS是目前較敏感快速方法，且容易開展 --測序是傳統(tǒng)的方法，但敏感度有限，過程復(fù)雜，不易普及做好組織標(biāo)本及DNA質(zhì)控是關(guān)鍵非腫瘤組織標(biāo)本的有效利用 --在無腫瘤組織情況下，外周血cfDNA、胸水及細(xì)針穿刺等細(xì)胞學(xué)標(biāo)本均可用于檢測EGFR突變，但其確切的敏感度與特異性尚需進(jìn)一步探索 --必須選擇足夠敏感的方法19非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR激酶抑制劑的耐藥性作為臨床上的最大問題，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產(chǎn)生耐藥。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突變的基礎(chǔ)上，又發(fā)生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M）。在EGFR-TKI治療前很少存在T790M（1～3%22）），這種情況下TKI難以有效。另外50%患者中，其中大約一半患者的耐藥性是由MET基因擴(kuò)增引起的，EGFR-TKI抗藥性出現(xiàn)時再進(jìn)行基因檢測，可以選擇與其耐藥機(jī)制相對應(yīng)的治療方法。即在一個患者的各種臨床情況中，掌握EGFR與相關(guān)基因的信息，以期進(jìn)一步改善臨床療效。20非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR激酶抑制劑耐藥的處理原則對于緩慢進(jìn)展的患者，建議繼續(xù)使用原來的EGFR-TKI治療或EGFR-TKI聯(lián)合化療；對于快速進(jìn)展的患者，推薦停用EGFR-TKI，改用化療；于局部進(jìn)展且原有病灶控制良好的患者，建議繼續(xù)使用EGFR-TKI并聯(lián)合局部治療。21非小細(xì)胞肺癌基因檢測EGFR激酶抑制劑耐藥研究進(jìn)展第一代EGFR抑制劑Gefitinib(易瑞沙,Iressa)和Erlotinib(特羅凱,Tarceva)隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥問題日益突出。其中，EGFR-T790M突變約占臨床耐藥病人的60%以上。第二代EGFR抑制劑Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批準(zhǔn)上市，于2014年1月在3期臨床研究中以失敗告終。Afatinib在體外對EGFR-T790M突變有活性，但臨床仍然未能克服T790M突變產(chǎn)生的耐藥性。第三代EGFR抑制劑。國外多個制藥公司和研究機(jī)構(gòu)都在開展對T790M突變的小分子抑制劑研究，其中包括克洛維斯腫瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291,但還沒有針對該突變的藥物上市。22非小細(xì)胞肺癌基因檢測ALK融合基因是新發(fā)現(xiàn)的NSCLC驅(qū)動基因，其中棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4（EML4）基因與ALK（間變性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）為最常見類型。ALK融合基因主要出現(xiàn)在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，且通常與EGFR基因突變不同時存在于同一患者。NSCLC患者中ALK融合基因的發(fā)生率約為5%，而在EGFR、KRAS、HER2或TP53等基因無突變的NSCLC患者中，ALK融合基因陽性率達(dá)25%；我國EGFR和KRAS均為野生型的腺癌患者中ALK融合基因的陽性率高達(dá)30%~42%。病理形態(tài)學(xué)研究提示在含印戒細(xì)胞的粘液型或?qū)嵭韵侔┲?，ALK的發(fā)生率高于其他類型的肺腺癌（46.2%vs8%）ALK陽性的NSCLC雖然僅占全部NSCLC的5%，但是每年新發(fā)病例數(shù)在中國仍接近30,000例ALK融合基因概念23非小細(xì)胞肺癌基因檢測目前檢測ALK融合基因的常用方法主要有熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基于PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上的技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法（IHC）。FISH目前仍是確定ALK融合基因的參照標(biāo)準(zhǔn)方法，但價格昂貴，操作規(guī)范要求較高，尚不適用于ALK陽性患者的篩查。實時熒光定量PCR操作簡便，敏感度高，但需要特定的試劑盒和儀器。IHC簡便易行、價格便宜、操作方法成熟。VentanaALK融合蛋白IHC診斷試劑盒在不影響特異度的前提下，進(jìn)一步提高了敏感度，與FISH結(jié)果的吻合率達(dá)到98.8%，可重復(fù)性達(dá)99.7%，已經(jīng)獲CFDA批準(zhǔn)用于診斷ALK陽性的NSCLC患者。ALK融合基因檢測方法24非小細(xì)胞肺癌基因檢測ALK融合基因陽性有效靶向藥物針對ALK靶點(diǎn)的小分子抑制劑克唑替尼（Crizotinib）是一種ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信號通路。臨床試驗顯示對于ALK陽性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，二線單藥治療患者的中位PFS為7.7個月，有效率達(dá)到65.3%

[4]?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄?，2013年初，中國食品和藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已批準(zhǔn)克唑替尼用于治療ALK融合陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者常見不良反應(yīng)（發(fā)生率