PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)創(chuàng)造之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶〔thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的根本原理PCR反響條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用提綱在PCR反響體系中參加熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR定義常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反響的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析。無法對起始模板準確定量，無法對擴增反響實時檢測。實時熒光定量PCR原理實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反響中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR原理--------擴增曲線擴增曲線圖：

橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值〔threshold〕：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號〔baseline〕，即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準差的10倍手動設(shè)置：原那么要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。C(t)value實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值那么極具重現(xiàn)性實時熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反響：X=X0*2n非理想的PCR反響：X=X0(1+Ex)nn：擴增反響的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率實時熒光定量PCR原理---------定量原理在擴增產(chǎn)物到達閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號到達閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:lgM=lgX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增到達域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。實時熒光定量PCR原理---------標準曲線模板DNA量越多，熒光到達域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量25提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量PCR原理

實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用非特異性熒光標記：1、SYBRGreenⅠ特異性熒光標記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實時熒光定量PCR原理---DNA產(chǎn)物的熒光標記QQR實時熒光定量PCR方法1－－－SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ法

SYBRGreenⅠ能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreenⅠ只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號〔一般設(shè)置在復(fù)性階段〕。SYBRGreen實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreenⅠ法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，有雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產(chǎn)物CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理模板DNA量越多，熒光到達域值的循環(huán)數(shù)越少。Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。SYBRGreenⅠ法--------PCR反響的建立反響體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreenⅠ使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否那么擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反響B(tài)uffer體系的優(yōu)化反響溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreenⅠ法應(yīng)用范圍起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反響的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。SYBRGreenⅠ法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高缺點本單位目前開展的工作多種病原體定量和定性細胞因子檢測〔人，小鼠，大鼠等〕基因表達水平檢測PCR芯片實時熒光定量PCR方法2-------TaqMan法與目標序列互補TaqMan---水解型雜交探針5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光〔熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，F(xiàn)RET〕Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqMan法PCR反響的建立1、引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反響參數(shù)確實定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S〔Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高〕也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同已肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴增病毒基因，以TaqMan探針進行檢測設(shè)置對照：濃度為106、105、104、103

的標準樣品各一個，設(shè)陰性和空白對照實驗步驟：提取HBVDNA

設(shè)計特異引物設(shè)計TaqMan探針并標記探針擴增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)利用TaqMan法檢測血液中的HBV數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果：HBVDNA的精確copy數(shù)為

3.7X105利用TaqMan法檢測血液中的HBVsamplesampleTaqMan法應(yīng)用范圍起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定單核苷酸多態(tài)性分析(singlenucleotidepolymorphism，SNP)TaqMan法優(yōu)缺點對目標序列的高特異性

------陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單

------與目標序列某一區(qū)域互補重復(fù)性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點實時熒光定量PCR方法3--Molecularbeacon法(分子信標)標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針Molecularbeacon(分子信標)工作原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移〔FRET〕探針與DNA雜交時產(chǎn)生熒光-----延伸過程：不產(chǎn)生熒光------退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號Molecularbeacon(分子信標)應(yīng)用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析Molecularbeacon(分子信標)優(yōu)缺點高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點只能用于一個特定目標設(shè)計困難價格比較高缺點幾種方法總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應(yīng)用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否復(fù)性/延伸熔解曲線分析定量和檢測目標基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復(fù)性SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟SNP分析定量和檢測目標基因?qū)崟r熒光定量PCR的實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反響的模板濃度〔DNA，RNA〕病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對定量：計算初始反響模板的相對含量差異表達分析芯片評估轉(zhuǎn)基因生物的檢測基因型檢測實時熒光PCR絕對定量方法unknown104103標準品，標準曲線濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反響得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標準曲線樣品與標準品同時進行PCR反響得到未知濃度樣品的C(t)值使用實時熒光定量PCR進行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝區(qū)分小差異樣品：24，48，96，……大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測100—1010省時有效實時熒光相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達差異〔倍數(shù)關(guān)系〕相對定量的問題解決樣品材料不均一造成的差異解決加樣過程中的差異內(nèi)標基因內(nèi)標通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小對目的基因進行均一化：目的基因拷貝／每一個內(nèi)標基因拷貝提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹

實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量PCR法標準樣品相對定量中的內(nèi)標內(nèi)標通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量絕對定量的標準樣品：拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA實時熒光定量PCR法－－標準樣品DNA拷貝數(shù)

用于生成標準曲線的樣品如何設(shè)定？含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋實時熒光定量PCR法定量方法絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標準曲線相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達差異〔不同時相〕2-△C〔t〕雙標準曲線法

TaqMan法舉例標記探針使用TaqMan探針進行雙通道熒光定量

Fam標記目標基因探針VIC標記看家基因探針TaqMan法舉例材料準備從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的

總RNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標準曲線

Contr