DNA和RNA-的分離及顯色

實驗三DNA和RNA的提取別離及顏色反響一、實驗目的學習用稀堿法從酵母中提取DNA和RNA利用不同濃度的NaCl溶液別離DNA和RNA了解核酸的顏色反響二、實驗原理酵母經稀堿處理可使酵母細胞壁溶解，核酸釋放到溶液，再經過濾，溶于液相中的核酸便與菌體殘渣別離，此發(fā)的優(yōu)點是簡便快速，溶于液相中的核酸含量較高。缺點是RNA在堿性條件下不穩(wěn)定，容易分解，因此在稀堿中不宜停留過長時間。利用在不同濃度的NaCl鹽溶液中DNA核蛋白與RNA核蛋白的溶解度不同的原理可別離DNA和RNA。由于RNA核蛋白易溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA核蛋白難溶于此鹽溶液中，這樣可通過離心別離使分開。上清液含有RNA，而沉淀中含有DNA，利用戊糖的顏色反響，就可以鑒定出DNA和RNA。顯色反響：核糖與地衣酚〔3,5-二羥甲苯〕試劑反響呈鮮綠色。脫氧核糖與二苯胺試劑反響生成藍色化合物，而核糖無此反響。RNA與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉變成糠醛，后者與3,5-二羥甲苯反響呈鮮綠色，該反響需用三氯化鐵和氯化銅作催化劑，反響產物在670nm處有最大吸收。RNA在20~250微克范圍內，光吸收與RNA濃度成正比。地衣酚反響特異性較差，但凡戊糖均有此反響。RNA和其他雜質也能給出類似的顏色。二苯胺反響根據對去氧戊糖的特異的顯色反響進行DNA定量的方法。其原理是DNA經酸處理，使從嘌呤核苷酸中游離出的去氧核糖在乙醛存在下和二苯胺反響，然后測定反響液的藍色。由于它不與RNA反響，所以可用來定量測定全核酸中的DNA含量。三、實驗材料1、材料干酵母2、儀器臺式天平電子天平沸水浴離心機3、器材 普通試管20mL×7〔枯燥〕 錐形瓶100mL×2 量筒50mL×1 移液器1mL×32mL×210mL×1 滴管×2洗耳球×2 濾紙漏斗試管架移液器架試管夾玻棒四、試劑的配置1、NaOH溶液〔0.5N〕 取20gNaOH，用水溶解并定1000mL。2、HCl〔1N〕 取83mL濃鹽酸，用水稀釋到1000mL。3、苔黑酚試劑 將200mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再參加 100mgFeCl3.6H2O4、二苯胺試劑 將1g二苯胺溶于98ml冰醋酸中，再參加2ml濃硫酸〔比重1.84〕〔臨用時配置，用前可加幾滴乙醛〕五、操作步驟1、取材 準備稱取干酵母2g，置于100mL錐形瓶中。2、堿液浸提 參加20mL0.5NNaOH溶液，用玻棒攪碎酵母，置于沸水浴中加熱5分鐘3、過濾4、別離DNA和RNA。顏色反響123456RNA核蛋白液（ml)0.20.2DNA核蛋白（ml)蒸餾（ml)0.810.81苔黑酚（ml)22二苯胺（ml)22反應在通風櫥內，沸水浴5分鐘顏色管號操作注意：地衣酚顯色法特異性較差，但凡戊糖均有此反響。因此，測RNA含量時可先測定DNA的含量，再計算出RNA的含量思考題1、本實驗中別離DNA和RNA方法的原理是什么？2、使用離心機應注意哪些事項？3、地衣酚反響中，干擾RNA測定的因素有哪些？如何能夠減少它們的影響？