人美版美術(shù)四年級(jí)上冊(cè)《刻印的樂(lè)趣》教案及人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)

課題《刻印的樂(lè)趣》（四上）執(zhí)教者武漢經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)軍山小學(xué)丁思課型造型·表現(xiàn)課時(shí)1教材分析造型表現(xiàn)的方式多種多樣，不僅僅限于最常用的繪畫方法?！犊逃〉臉?lè)趣》就是本套教材版畫系列中的一課，也可以說(shuō)，這一課是啟發(fā)同學(xué)們運(yùn)用不同制版方法學(xué)以致用的一課。在本課可以用的材質(zhì)很豐富，可以進(jìn)行多樣化的創(chuàng)造表現(xiàn)。同時(shí)，學(xué)生通過(guò)動(dòng)手活動(dòng)，將制作與運(yùn)用相結(jié)合，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)作熱情，鼓勵(lì)學(xué)生大膽創(chuàng)作。學(xué)情分析這一課是啟發(fā)同學(xué)們運(yùn)用不同制版方法學(xué)以致用的一課。可以刻印的材料是非常豐富的，泥板、紙板、石膏板、木制品、塑料制品、金屬制品等不勝枚舉。在本課中，教材著重介紹了比較利于中高年級(jí)學(xué)生操作的石膏、橡皮、薯類等原料。當(dāng)然，在教學(xué)中根據(jù)實(shí)際情況，我們運(yùn)用的是橡皮，在課后，我會(huì)鼓勵(lì)讓學(xué)生嘗試蘿卜、紅薯、土豆等易于搜集制作的材質(zhì)，進(jìn)行更加多樣化的創(chuàng)造表現(xiàn)。教學(xué)目標(biāo)知識(shí)與技能通過(guò)本課學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握簡(jiǎn)單的刻、印方法，認(rèn)識(shí)陰印和陽(yáng)印，感受造型藝術(shù)手段的多樣性；過(guò)程與方法運(yùn)用刻印的方法創(chuàng)作簡(jiǎn)單的圖案，包括嘗試“正反”、“陰陽(yáng)”的刻印方法，并印制成出賀卡、書簽等工藝品；情感、態(tài)度與價(jià)值觀運(yùn)用學(xué)習(xí)到的刻、印技法制作工藝品，引發(fā)學(xué)生的創(chuàng)作欲望，體驗(yàn)刻印的樂(lè)趣，提高學(xué)生的動(dòng)手能力。教具與學(xué)具教師課件、微課、刻印成品、印制的工藝品、半成品等。學(xué)生制版材料（鉛筆、刻刀、橡皮等）；印制材料（印臺(tái)等）。教學(xué)重難點(diǎn)重點(diǎn)認(rèn)識(shí)陰刻和陽(yáng)刻，學(xué)習(xí)刻印的方法并加以運(yùn)用。難點(diǎn)刻印的具體方法和要求。（安全問(wèn)題）教學(xué)過(guò)程教學(xué)環(huán)節(jié)教師活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)設(shè)計(jì)意圖設(shè)疑導(dǎo)入探究1：什么方法表現(xiàn)的？探究2：用什么印的？引出課題。小組討論；學(xué)生猜想。激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)自主探究能力。新授播放各種各樣的刻印作品；問(wèn)：刻印的用處？學(xué)生欣賞并思考；了解刻印知識(shí)，知道陰、陽(yáng)刻以及“反刻正印”；感受刻版過(guò)程，學(xué)習(xí)持刀和刻印方法；同時(shí)讓學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，并集體尋求解決問(wèn)題的方法，培養(yǎng)學(xué)生自主解決問(wèn)題的能力；引導(dǎo)學(xué)生理解陰印與陽(yáng)印以及陰陽(yáng)結(jié)合。幫助視頻中的孩子解決問(wèn)題。學(xué)習(xí)陰刻和陽(yáng)刻以及陰陽(yáng)刻。引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)“反刻正印”。幫助視頻中的孩子解決問(wèn)題。學(xué)習(xí)“反刻正印”。播放刻印中“陽(yáng)刻”的制作微課。學(xué)生進(jìn)一步學(xué)習(xí)刻印的方法和步驟；學(xué)生學(xué)習(xí)的同時(shí)思考自己的構(gòu)圖。學(xué)生創(chuàng)作教師輔導(dǎo)并強(qiáng)調(diào)安全。學(xué)生實(shí)踐。學(xué)生感受刻印的樂(lè)趣；教師指導(dǎo)運(yùn)刀方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，并肯定學(xué)生的表現(xiàn)。評(píng)價(jià)小結(jié)教師評(píng)價(jià)并小結(jié)。引導(dǎo)學(xué)生從構(gòu)思，印制效果等方面評(píng)價(jià)。學(xué)生自評(píng)、互評(píng)。學(xué)生相互交流好的經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)用“刻印”的方法裝點(diǎn)我們的生活。拓展延伸刻印的應(yīng)用。學(xué)生欣賞并感嘆。學(xué)生發(fā)現(xiàn)刻印的樂(lè)趣。操作指南運(yùn)輸和保存：人胚胎干細(xì)胞（hESCs）和PMEFi被裝在含90％FCS和10％二甲基亞砜的凍存管中，hESCs4×105/管，可接種一個(gè)3.5cm培養(yǎng)皿（或六孔板的一個(gè)孔），PMEFi4×106/管，可接種一塊六孔板。凍存管用干冰運(yùn)輸，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80培養(yǎng)條件：溫度：37±0.5CO2濃度：5.1±0.6％相對(duì)濕度：85-100%主要技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)：當(dāng)進(jìn)行hESC培養(yǎng)時(shí)，總的培養(yǎng)原則必需遵守，所有的操作都應(yīng)該在相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)間和超凈臺(tái)內(nèi)按無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行。此外，通過(guò)安裝空氣處理和過(guò)濾設(shè)備減少空氣顆粒制造一個(gè)相對(duì)潔凈的空間。當(dāng)接觸和細(xì)胞有關(guān)的一切試劑和材料時(shí)，應(yīng)該帶手套（包括開冰箱門）。工作間在使用前后要用70％的異丙醇徹底消毒。培養(yǎng)液和材料所有的培養(yǎng)液和試劑在使用前都要用0.2μm的濾膜過(guò)濾；培養(yǎng)瓶和TC材料在拿進(jìn)培養(yǎng)間之前都應(yīng)該用70％異丙醇消毒。細(xì)胞處理為了便于操作，最好不要同時(shí)處理兩個(gè)以上的標(biāo)本。操作時(shí)，在室溫和低CO2的時(shí)間不要太長(zhǎng)。所有的細(xì)胞離心：室溫，500－600g培養(yǎng)液準(zhǔn)備：MEF和hESCs培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下進(jìn)行，完成后用0.2μm的濾膜過(guò)濾。當(dāng)準(zhǔn)備hESCs培養(yǎng)液時(shí)，保持一致性很重要。如有可能，盡量使用相同的試劑。使用滿足于附錄提供的血清替代品尤為重要。生長(zhǎng)因子應(yīng)該最后添加，需要強(qiáng)調(diào)的是bFGF進(jìn)行重懸時(shí)需要蛋白載體，在少量培養(yǎng)液中不要試圖重懸它。MEF培養(yǎng)液：hESCs培養(yǎng)液：冷凍培養(yǎng)液：90％FCS+10%二甲基亞砜,0.2μm的濾膜過(guò)濾,4℃明膠準(zhǔn)備：用超純水配制0.1％明膠溶液，加熱確保明膠完全溶解，使用前高壓或0.2μm的濾膜過(guò)濾。明膠包被：接種細(xì)胞前，用0.1％明膠溶液包被培養(yǎng)皿，37℃至少30分鐘，分別用1.5或4ml包被35mm或準(zhǔn)備MEF：可靠的MEF對(duì)hESCs的生長(zhǎng)和存活是非常重要的。每管含4×106PMEFi，可接種一塊六孔板。在復(fù)蘇/傳代hESCs前一到二天接種PMEFi，MEFs超過(guò)12－14天不能再用作滋養(yǎng)層。種植MEFs：37℃預(yù)溫MEF培養(yǎng)液，吸10ml到15ml無(wú)菌離心管中。從-80℃取出MEF冷凍管，立即沁入37℃水浴中，大約30－45秒，細(xì)胞有80％融化時(shí)取出，立即拿進(jìn)超凈臺(tái)，70％異丙醇消毒。把細(xì)胞加有培養(yǎng)液的離心管中，最好用1ml培養(yǎng)液沖洗凍存管，也加到離心管中。500－600g，離心5分鐘。離心同時(shí)，從培養(yǎng)皿中吸出明膠，離心后，小心棄去上清，用12ml（6個(gè)孔）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，充分混勻，每孔加入2ml6小時(shí)后細(xì)胞貼壁，最好在接種24－48小時(shí)使用，不要使用超過(guò)4天的MEF.hESdells所得到的hEScells在10cm培養(yǎng)長(zhǎng)滿后，分裝6瓶，密度4×105cells/ml—對(duì)于絕大多數(shù)冷凍管。HUES-9為0.5ml，復(fù)蘇時(shí)時(shí)間要比其系短一些。建議每管復(fù)蘇到一個(gè)35mm培養(yǎng)皿中，或6孔皿的一個(gè)孔。復(fù)蘇接種hES細(xì)胞：復(fù)蘇前應(yīng)確保MEF已經(jīng)被準(zhǔn)備好且狀態(tài)良好，不要應(yīng)用MEF狀態(tài)不好或超過(guò)3天的皿，建議事先標(biāo)記好所有的離心管和培養(yǎng)皿。預(yù)溫hES培養(yǎng)液到37℃，一個(gè)細(xì)胞系吸取10mlhES培養(yǎng)液到無(wú)菌的和標(biāo)好的15ml離心管中，從液氮中取出hES冷凍管，立即將冷凍管的下半部浸入37℃水浴中，大約45~60秒，細(xì)胞80%融化時(shí)從水浴中取出，立即將冷凍管拿到超凈臺(tái)中，70%酒精消毒，輕輕移入10ml預(yù)溫培養(yǎng)基中。建議用1ml預(yù)溫培養(yǎng)液洗冷凍管后一并移入15ml離心管500~600g，5min，離心時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出MEFS，在超凈臺(tái)里吸出培養(yǎng)液（需要幾個(gè)孔吸幾個(gè)孔），立即加入1mlhES培養(yǎng)液，小心不要碰到MEFS，將其放置在超凈臺(tái)內(nèi)，離心完后，小心吸出培養(yǎng)液，不要碰觸離下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)（如有必要不要吸出所有的培養(yǎng)液。用1ml培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞團(tuán)，將1mlhES溶液輕輕滴加到預(yù)先加入1mlhES培養(yǎng)液的MEF上，和MEF一樣盡管使其均勻分布在培養(yǎng)皿上，輕輕移入培養(yǎng)箱，hES細(xì)胞培養(yǎng)hES細(xì)胞培養(yǎng)是費(fèi)力的，除了復(fù)蘇/傳代的之外，培養(yǎng)液應(yīng)該每天被更換。此外，復(fù)蘇或傳代之后經(jīng)常出現(xiàn)生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象。因此，每天觀察細(xì)胞非常重要，必須保證提前兩天準(zhǔn)備MEF，因?yàn)閭鞔臅r(shí)間可能會(huì)超出你的預(yù)期。請(qǐng)注意，我們已經(jīng)觀察到在這些HUES細(xì)胞系，染色體的改變包括12三體（在兩個(gè)細(xì)胞系：hVES-3和4）和其它改變（HUES-12號(hào)染色體增加）。這些染色體的異常與增殖特點(diǎn)和雙鏈期短等有關(guān)。由于染色體異常在hES細(xì)胞系中是普遍的，建議經(jīng)常進(jìn)行染色體分析。Day1hES細(xì)胞復(fù)蘇24h后，4倍光鏡觀察，能看到有一些碎屑，這是正常的，不用擔(dān)心，這些碎屑是死細(xì)胞的混合物。在這個(gè)早期階段，不要指望看到一些細(xì)胞團(tuán)，如果死細(xì)胞層完全覆蓋孔皿，建議更換部分培養(yǎng)液。Day2-4通常復(fù)蘇48h后第一次全部換液，建議2ml/well，復(fù)蘇后第二天細(xì)胞團(tuán)可以看到，以后每天更換培養(yǎng)液。Day4-7根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，復(fù)蘇后最早4天最晚10天（此時(shí)MEF太老了）需要傳代。傳代前的天數(shù)通常依賴很多因素，包括被復(fù)蘇細(xì)胞的狀態(tài)，平均起來(lái)，培養(yǎng)接近長(zhǎng)滿大約需要7天時(shí)間，對(duì)于一個(gè)給定的細(xì)胞系如何操作，請(qǐng)和我們聯(lián)系。如果復(fù)蘇的細(xì)胞不能重現(xiàn)附錄中描述的景象也不要?dú)怵H，我們已經(jīng)注意到在復(fù)蘇時(shí)有些不一致，一些細(xì)胞系比另外一些更穩(wěn)定，出現(xiàn)不協(xié)調(diào)、扁平的細(xì)胞團(tuán)，也是不少見的，甚至在極個(gè)別情況下全出現(xiàn)單層細(xì)胞，此時(shí)不要放棄，HVES細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)在傳一到兩代后得到改善是很常見的。hES細(xì)胞傳代復(fù)蘇4~7天后，細(xì)胞接近融合，接近融合的細(xì)胞通常1∶3傳代。在細(xì)胞分化前進(jìn)行傳代是非常重要的，如果細(xì)胞團(tuán)在接近融合前開始變得帶褐色，需要提早1∶2傳代。同樣，如果細(xì)胞密度太大傳代時(shí)也需要調(diào)整（平均分配，彼此接觸）。1∶3傳代傳代之前，確保你有預(yù)先鋪好MEF的3孔皿。MEF貼壁24h，但不超過(guò)3天。37℃下面的步驟要迅速以減少細(xì)胞沒(méi)有hES培養(yǎng)液的時(shí)間。從培養(yǎng)皿吸去hES培養(yǎng)液，用1×PBS輕輕洗孔皿，吸去PBS，加入0.3ml0.05%胰酶到孔皿中，蓋上蓋，在4倍光鏡下觀察細(xì)胞，hES細(xì)胞團(tuán)周圍的MEF開始回縮。當(dāng)MEF充分變圓及hES細(xì)胞團(tuán)界限變得粗糙時(shí)，放回超凈臺(tái)，加2ml預(yù)溫hES培養(yǎng)液到消化的細(xì)胞上，輕輕吹吸，洗皿底，直到MEF單細(xì)胞層完全分離（單細(xì)胞層很粘，可能仍有少量貼壁）。把細(xì)胞懸液移入預(yù)先加入10ml培養(yǎng)液的離心管中，用1ml培養(yǎng)液洗孔皿，同樣加到離心管中，此時(shí)，胰酶完全被抑制。用加樣器吹吸細(xì)胞懸液5~7次，分別將1ml懸液均勻滴加到孔皿中，不要晃動(dòng)瓶皿，將孔皿輕輕放入37℃?zhèn)鞔鷋ES細(xì)胞與其上代復(fù)蘇細(xì)胞特征相似。MEF原代培養(yǎng)鼠準(zhǔn)備：性交后12.5天的孕鼠。鼠胚收集：收集前，用明膠包被15cm組織培養(yǎng)皿，1.5~2胚胎/皿，每只鼠大約12胚胎（需6~8個(gè)培養(yǎng)皿）。此外，準(zhǔn)備盛有PBS×1的10cm培養(yǎng)皿3個(gè)/鼠。37℃處死孕鼠，從子宮中取出胚胎置于1×PBS。在超凈臺(tái)顯微鏡下從胎膜中取出胚胎，解剖去其內(nèi)臟（腸、肝、心臟等）。把干凈的胚胎移到一個(gè)干燥、無(wú)菌的10cm培養(yǎng)皿中。用無(wú)菌手術(shù)剪刀切碎胚胎，加0.05%胰酶10ml/10~14胚胎，反復(fù)吹吸直到胚胎小塊均勻散開，將溶液移至50ml離心管中，37℃接種原代MEFS加入40ml預(yù)溫的MEF培養(yǎng)液至溶液中，500~600×g.RT.10′.棄掉上清，加入30ml預(yù)溫MEF培養(yǎng)液重懸沉淀，接種1.5~2個(gè)胚胎（5ml溶液）/15cm明膠包被培養(yǎng)皿，終體積為20ml，37℃培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿后，1∶3或1∶4傳代到新的25cm組織培養(yǎng)皿上（不用明膠包被），37℃原代MEF凍存預(yù)溫MEF培養(yǎng)液和0.05%胰酶，將冷凍培養(yǎng)液置于冰上，向50ml離心管中加20ml預(yù)溫培養(yǎng)液（MEF）（3個(gè)皿一管），同時(shí)取出3個(gè)培養(yǎng)皿，棄掉培養(yǎng)液，1×PBS5ml洗一次，加5ml胰酶/皿，讓細(xì)胞回縮，將胰酶溶液吸到50ml離心管中，用另外5ml胰酶洗三個(gè)皿一次，同樣加到離心管中，最后用10ml預(yù)溫MEF培養(yǎng)液再洗一次，加到離心管中，1000×g離心5分鐘，棄上清，加9ml冷凍培養(yǎng)液重懸（1∶3冷凍）。每個(gè)管中加入1ml（約3×106細(xì)胞），1℃分冷凍（？包好-80℃過(guò)夜），液氮貯存。MEF傳代一瓶原代MEF4~7天將長(zhǎng)滿15cm培養(yǎng)皿，大約有10×106個(gè)細(xì)胞（6孔皿約3×106/6孔）。預(yù)溫MEF培養(yǎng)液，向50ml離心管中加入10ml/冷凍管，從液氮中取出冷凍管立即將其下半部浸入37℃水浴中，停留45~60秒，此時(shí)細(xì)胞約80%融化（少部分未融），迅速拿到超凈臺(tái)中，70%酒精消毒，將細(xì)胞輕輕移入預(yù)溫培養(yǎng)液中，500~600×g離心，加5ml/管重懸細(xì)胞，將15ml預(yù)溫MEF培養(yǎng)液加入15cm培養(yǎng)皿中，將5mlMEF溶液加到15cm培養(yǎng)皿中，均勻分配，標(biāo)記（日期，第2代P2），37MEF處理MEF一旦長(zhǎng)滿，必須用絲裂霉素C或δ射線抑制其分裂。絲裂霉素C抑制有絲分裂用MMC處理培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)液15ml/皿，加到50ml離心管中，加入適量MMC使終濃度為10μg/ml，混合溶液，棄掉每個(gè)皿中剩余的5ml培養(yǎng)液，將離心管中含MMC的培養(yǎng)液回加到培養(yǎng)皿中，15ml/皿，37℃預(yù)溫MEF培養(yǎng)液和0.05%胰酶到37℃從孵箱中同時(shí)取出3個(gè)皿，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS