PCR引物設(shè)計(jì)及Primer5.0使用介紹

PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用主要內(nèi)容PCR介紹引物設(shè)計(jì)原理引物設(shè)計(jì)的優(yōu)化原那么PrimerPremier5.0介紹舉例說(shuō)明引物的設(shè)計(jì)抗癌抗衰老的紫色西紅柿補(bǔ)鈣的胡蘿卜滿(mǎn)地盡是黃金米

幫孩子保護(hù)眼睛抗凍的草莓會(huì)有魚(yú)腥味么？帶有胰島素基因的生菜當(dāng)蘋(píng)果愛(ài)上葡萄的時(shí)候散發(fā)檸檬香味的西紅柿富含多種維生素

玉米中的超級(jí)精英一切只是夢(mèng)想？

一切皆有可能！基因別離酶切載體酶切基因和載體連接導(dǎo)入細(xì)菌重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達(dá)等研究導(dǎo)入植物細(xì)胞基因工程的根本流程PCR介紹1、什么是PCR2、PCR的組成3、如何提高PCR成功率〔定量，對(duì)照〕引物設(shè)計(jì)原理引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)適宜的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物設(shè)計(jì)總體上包含三個(gè)程序：序列下載，同源性比較，引物設(shè)計(jì)篩選。引物設(shè)計(jì)的原那么1、引物長(zhǎng)度大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500bp，選用短的(16～18)的引物；假設(shè)產(chǎn)物長(zhǎng)5kb，那么用24個(gè)核苷酸的引物。有人用20～23個(gè)核苷酸引物得到40kb的產(chǎn)物。引物設(shè)計(jì)的原那么2、引物GC含量GC含量在40%－60%之間，以45-55％為宜。這可為有效退火提供足夠熱。引物設(shè)計(jì)的原那么3、引物Tm引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm值最好72℃左右。至少要在55－80℃之間。Tm=2(A+T)+4(C+G)引物設(shè)計(jì)的原那么4、引物3’端引物3’末端和模板的堿基完全配對(duì)防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性考慮末端5個(gè)堿基的ΔG引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位引物設(shè)計(jì)的原那么5、引物序列與模板序列組成的相似性可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高那么錯(cuò)誤引發(fā)率高。引物設(shè)計(jì)的原那么6、最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件〔比方DNAman〕比對(duì)〔Alignment〕，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。引物設(shè)計(jì)的原那么7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否那么引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)〔Hairpin〕使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物設(shè)計(jì)的原那么8、堿基要隨機(jī)分布引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)〔Falsepriming〕。引物設(shè)計(jì)的原那么9、引物應(yīng)具有特異性引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。引物設(shè)計(jì)的原那么10、ΔG值ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線(xiàn)形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過(guò)9〔ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值〕，如此那么有利于正確引發(fā)反響而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。引物設(shè)計(jì)的原那么11、引物的5′端引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾，引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物設(shè)計(jì)的原那么12、在DNA測(cè)序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物

PrimerPremier5.0簡(jiǎn)介主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)2、限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介紹PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類(lèi)型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為總分值每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒(méi)有But…引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow任務(wù)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1舉例說(shuō)明SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的編碼序列(~4000bp)紅色為信號(hào)肽,藍(lán)色為BamHI酶切位點(diǎn),下劃線(xiàn)標(biāo)出酶切位點(diǎn)的閱讀框ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)引物要求PCR擴(kuò)增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點(diǎn)保證NR1的閱讀框不改變5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：擴(kuò)增GFP根本序列變性,引物復(fù)性第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA〔GC:60%,Tm：64〕Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC〔GC:57%,Tm：66〕第三步：酶切位點(diǎn)Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA〔GC:60%,Tm：64〕Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC〔GC:57%,Tm：66〕BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaa