TCPMA 027-2023 病原微生物菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)株 艾滋病病毒毒株建立技術(shù)規(guī)范

ICS11.020CCSC04團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CPMA027—2023病原微生物菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)株艾滋病病毒毒株建立技術(shù)規(guī)范Standardstrainsofpathogenicmicroorganism—technicalspecificationforestablishmentofHIVstrains2023-02–02布 2023-02-02施中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì) 發(fā)布T/CPMA027—2023T/CPMA027—2023II目 次前言 II112范引文件 13語(yǔ)定義 14本求 25離養(yǎng)滴要求 2分培養(yǎng) 2擴(kuò)培養(yǎng) 2病滴定 26定求 2基型定 2表鑒定 37價(jià)求 3基要求 37.2活性 3穩(wěn)性 38息求 39藏求 310量制生安要求 4附錄A（范）HIV株分鑒技術(shù) 5A.1HIV毒分培滴定 5A.2HIV毒基型定 5A.3HIV毒嗜和體誘特鑒定 6附錄B（范）HIV準(zhǔn)株息述 7參考獻(xiàn) 9T/CPMA027—2023T/CPMA027—2023IIII前 言GB/T《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1本文件由中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)歸口。T/CPMA027—2023T/CPMA027—2023PAGEPAGE1病原微生物菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)株艾滋病病毒毒株建立技術(shù)規(guī)范范圍（毒（GB19489—2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T37864—2019生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求（ISO20387：2018，IDT）WS293—2019艾滋病和艾滋病病毒感染診斷WS315—2010毒812—2022病原微生物菌毒T/CPMA011—2020（）WS293—2019和WS315—2010界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。艾滋病病毒humanimmunodeficiencyvirus；HIV人免疫缺陷病毒導(dǎo)致艾滋病的病原體。[來(lái)源：WS293—2019，2.1]毒株virusstrains可在體外培養(yǎng)、具有保藏價(jià)值、經(jīng)鑒定和分類并給予固定編號(hào)的病毒。HIV標(biāo)準(zhǔn)株HIVstandardstrains具有HIV典型生物學(xué)特征，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證、可追溯，且具有HIV型及亞型的代表性,由保藏機(jī)構(gòu)復(fù)核、鑒定，并給予固定編號(hào)的HIV毒株。以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)株。HIV耐藥株HIVdrugresistantstrains攜帶HIV耐藥基因突變、對(duì)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物具有耐受性的HIV毒株。以下簡(jiǎn)稱耐藥株。病毒滴度virustitres單位體積中感染性病毒的數(shù)量。注：以病毒的50%組織培養(yǎng)感染劑量（50%TissueCultureInfectiousDose,TCID50）表示。病毒載量viralload血漿（清）中HIVRNA的數(shù)量。注：用每毫升（mL）血漿(清)中HIVRNA的拷貝數(shù)（copies,CPs)或國(guó)際單位（IUs)來(lái)表示(CPs/mL或IUs/mL)。T/CPMA027—2023T/CPMA027—2023PAGEPAGE2p24抗原p24antigenHIV-1的核心蛋白。注：在HIV-1分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中p24抗原的濃度可監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制情況。全長(zhǎng)基因序列full-lengthgenomicsequence約9700bp的HIV全長(zhǎng)核苷酸序列。保藏preservation毒毒[來(lái)源：WS315—2010，3.2，有修改]保藏機(jī)構(gòu)preservationorganization[來(lái)源：WS315—2010，3.3，有修改]病毒嗜性virustropismHIV與宿主CD4+T細(xì)胞表面的CCR5或CXCR4輔助受體選擇性結(jié)合的生物學(xué)特性。合胞體誘導(dǎo)syncytiainducing；SIHIV感染導(dǎo)致細(xì)胞融合形成合胞體的過(guò)程。新鮮抗凝全血、血漿、外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）、腦脊液、精液等用于HIV分離培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌采集。病毒分離培養(yǎng)上清液用于HIV擴(kuò)增、滴定、基因型及重組、表型、耐藥表型鑒定等檢測(cè)。HIVPBMC與HIVPBMCp24A.1擴(kuò)增培養(yǎng)應(yīng)使用待擴(kuò)增的培養(yǎng)上清液接種健康人PBMC，培養(yǎng)上清液的p24抗原濃度達(dá)到1ng/mL以上時(shí)，為擴(kuò)增培養(yǎng)成功。測(cè)定HIV的感染性滴度應(yīng)采用終點(diǎn)稀釋法。HIV3（gagpolA.2T/CPMA027—2023T/CPMA027—2023PAGEPAGE3CCR5和或CXCR4病毒培養(yǎng)上清液接種MT-2細(xì)胞，觀察合胞體的形成，判斷是否為SI表型。檢測(cè)應(yīng)符合A.3.3.2的規(guī)定。50基本要求WS/T812—2022活性350105TCID/mL50穩(wěn)定性HIV37℃±0.5℃，CO25％±0.193％±2.5％。gagpolenv350信息應(yīng)完整，包括基本信息、基物信息、特征信息、保存單位聯(lián)系信息。p24傳代信息應(yīng)明確，包括培養(yǎng)代次、周期和各代次收集時(shí)間等。如曾使用該毒株進(jìn)行研究，應(yīng)提供包括目的、方法和結(jié)果等信息。T/CPMA011—2020HIVB標(biāo)準(zhǔn)株應(yīng)在不同地點(diǎn)、設(shè)備或以不同方法備份保藏。應(yīng)在液氮或-140℃以下深低溫冷凍保藏，對(duì)保藏設(shè)備及環(huán)境條件進(jìn)行溫度監(jiān)控和記錄。應(yīng)建立保藏信息系統(tǒng)，保藏、使用、庫(kù)存、銷毀等信息應(yīng)清晰、可追溯。GB19489—2008注：2006版中的艾滋病毒即本文件中的艾滋病病毒。GB/T37864—2019（2020）HIV樣本

附錄A（規(guī)范性）HIV毒株分離鑒定技術(shù)分離培養(yǎng)首選HIV感染者的PBMC，也可使用新鮮抗凝全血、血漿、腦脊液、精液以及其他體液。滴定一般使用病毒培養(yǎng)上清液。RPMI1640、HIV-1p24CO2分離培養(yǎng)HIV毒株采用健康人PBMC作為培養(yǎng)細(xì)胞。將感染者樣本與培養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)2周～4周后，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV-1p24抗原濃度，終點(diǎn)稀釋法測(cè)定HIV的感染性滴度。HIV-1p242p24HIV-1p241ng/mLPBMCHIV-1p24病毒分離培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照，宜設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。HIV樣本HIV病毒培養(yǎng)上清液（見A.1.4.2）。主要試劑包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、HIV3個(gè)基因片段（gag、pol和env）的引物和探針、DNA測(cè)序試劑等。主要設(shè)備包括PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、測(cè)序儀等。RNAcDNAgag、polenvPCRPCRDNApol使用權(quán)威機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因序列比對(duì)，通過(guò)基因遺傳距離分析鑒定毒株的基因型。應(yīng)使用已知基因亞型毒株的序列作為參考序列。HIV樣本HIV病毒培養(yǎng)上清液（見A.1.4.2）。L-CO2病毒培養(yǎng)上清液加入表達(dá)CCR5和/或CXCR4的GHOST細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，檢測(cè)細(xì)胞的綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）病毒培養(yǎng)上清液加入MT-2細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)2周～3周顯微鏡下觀察MT-2細(xì)胞融合現(xiàn)象。GHOSTGFP5CCR5CCR5CXCR4CXCR4（nonsyncytiainducing,NSI）應(yīng)使用已知嗜性和合胞體誘導(dǎo)表型的毒株作為陽(yáng)性對(duì)照。HIV標(biāo)準(zhǔn)株信息描述見表B.1。

附錄B（規(guī)范性）HIV標(biāo)準(zhǔn)株信息描述表B.1HIV標(biāo)準(zhǔn)株信息描述信息內(nèi)容示例a基本信息中文名稱b艾滋病病毒標(biāo)準(zhǔn)株英文名稱bHIVstandardstrain資源庫(kù)編號(hào)NPRC2021.01001毒株保藏編號(hào)CHPC2021.01001原始編號(hào)b304379數(shù)量和體積b1mL/支，2支毒株來(lái)源歷史b←中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病原微生物菌（毒）種保藏中心←中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所保藏時(shí)間2021-06-01分離時(shí)間b2020-08-17分離地址b中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市和平區(qū)分離基物bHIV感染者PBMC基物信息樣本描述bHIV感染者全血樣本采集時(shí)間b2020-5-19樣本采集地址b中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市和平區(qū)HIV感染者/艾滋病患者信息性別b男年齡b30臨床分期I期（無(wú)癥狀期）感染途徑b男男同性傳播診斷時(shí)間b2020-5-19治療情況b樣本采集時(shí)未治療檢測(cè)情況CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)：377個(gè)/μL病毒載量：66900CPs/mL特征信息p24抗原濃度b10000pg/mL病毒滴度b105TCID/mL50傳代信息b第2代，培養(yǎng)周期28天，培養(yǎng)第11天收集基因型bCRF01_AE用于基因型鑒定的基因片段b3（env、gagpol）全長(zhǎng)基因序列無(wú)耐藥基因型b無(wú)耐藥位點(diǎn)（參考斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)/，2020年）耐藥表型對(duì)AZT、d4T、ddI、3TC和EFV均敏感合胞體誘導(dǎo)表型非合胞體誘導(dǎo)型（NSI）病毒嗜性表型bCCR5保存單位聯(lián)系信息聯(lián)系人張XX聯(lián)系電話024-XXXXXXXX聯(lián)系人郵箱XXXX聯(lián)系人所在單位中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所a示例供參考,使用填寫時(shí)表格僅有信息和內(nèi)容。b必要信息，其余為非必要信息。參 考 文 獻(xiàn)［1］WHO-UNAIDSGuidelinesforStandardHIVIsolationandCharacterizationProcedures(SecondEdition,2002)，WHO-UNAIDSHIVVaccineInitiative,InitiativeforVaccineResearch,HealthTechnologyandPharmaceuticals,WorldHealthOrganization.ISBN921590211［2］ （［2006］15號(hào)）2006［3］ WS315—2010毒2010［4］ WS293—2019［5］ (2021，2022，13（2）：203-226［6］全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(2020年修訂版)。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，2020［7］ BergMG,YamaguchiJ,Alessandri-GradtE,etal.Apan-HIVstrategyforcompletegen