體外皮膚變態(tài)反應 U937細胞激活試驗方法

附件6體外皮膚變態(tài)反應U937細胞激活試驗方法U937CellLineActivationTest1范圍本方法規(guī)定了體外皮膚變態(tài)反應U937細胞激活試驗的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品用化學原料潛在致敏性的評價。2試驗目的本試驗用于檢測體外培養(yǎng)的人組織細胞淋巴瘤細胞表面標記物CD86的表達變化，以評價受試物引起皮膚變態(tài)反應的可能性。3定義3.170%細胞存活率濃度值70%cellviability（CV70）受試物染毒后，細胞存活率為70%時對應的受試物濃度值。3.2刺激指數(shù)stimulationindex（S.I.）與溶劑對照相比，扣除同型對照后流式細胞儀測定的受試物陽性細胞相對強度值。3.3CD86有效作用濃度值EffectiveConcentration150（EC150）CD86的相對熒光強度值達到150時對應的受試物濃度值。4試驗的基本原則當致敏物質(zhì)接觸皮膚后，樹突狀細胞在移動到淋巴器官的過程中分化成熟，并上調(diào)一系列表面分子的表達。體外培養(yǎng)類樹突狀細胞：人組織細胞淋巴瘤細胞，并和受試物共暴露48h后，使用熒光抗體染料對細胞表面分子CD86染色并用流式細胞儀測定，從而評價受試物是否具有致敏性。5試劑5.1細胞選用人組織細胞淋巴瘤細胞（Thehumanhistiocyticlymphomacellline，U937細胞）。細胞使用前應進行穩(wěn)定性檢測。推薦使用cloneCRL1593.2細胞株。5.2培養(yǎng)基RPMI1640基礎培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、適量抗生素，配制成1640完全培養(yǎng)基。5.3染色緩沖液磷酸鹽緩沖液中加入5%的胎牛血清。5.4染料和抗體類物質(zhì)7-氨基放線素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidiumiodide,PI）FITC標記的小鼠單克隆CD86抗體（FITC-CD86）FITC標記的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6試驗方法6.1細胞準備6.1.1細胞培養(yǎng)U937懸浮細胞使用1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。細胞復蘇一周并通過穩(wěn)定性檢測后可開展試驗。細胞最大培養(yǎng)濃度不超過2×106個/mL，復蘇后使用不超過6周，傳代次數(shù)不超過21代。6.1.2細胞穩(wěn)定性檢測細胞復蘇兩周后，選用松香酸（AA）或2,4,6-三硝基苯磺酸作為陽性對照，乳酸（LA）作為陰性對照。當細胞可以準確對陽性物質(zhì)和陰性物質(zhì)進行穩(wěn)定區(qū)分時視為通過穩(wěn)定性檢測。6.2受試物處理溶劑：完全培養(yǎng)基（優(yōu)先選擇）或二甲基亞砜（DMSO）受試物儲備液：第一次運行至少選擇6個濃度。于試驗前一天制備，應用1640完全培養(yǎng)基配制0.4mg/mL的受試物溶液，或者應用DMSO配制50mg/mL的受試物溶液。由于沒有進行劑量測定，因此在第一次運行時，應在相應的溶劑中配制6種系列濃度儲備液（最終濃度為1、10、20、50、100和200μg/mL）。受試物工作液：于試驗當天制備，用完全培養(yǎng)基配制的受試物溶液可以直接使用，用DMSO配制的受試物溶液需用完全培養(yǎng)基稀釋125倍得到工作溶液。將工作液等體積加入細胞懸液中進行染毒，即最終細胞接觸濃度是工作液濃度再稀釋2倍。連續(xù)運行的濃度選擇：基于第一次運行的結(jié)果選擇至少4個第二次運行的濃度，任何后續(xù)運行的濃度都是基于之前所有運行的單個結(jié)果來選擇。由于濃度間隔設置較小會影響濃度效應，所以建議以下推薦使用的最終濃度(單位：μg/mL)進行試驗：1、2、3、4、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200。如果以上濃度無法測得受試物的70%細胞存活率濃度值（70%cellviability，CV70），可以進行濃度調(diào)整。但受試物最終細胞接觸濃度最高不超過200μg/mL；如果CD86的陽性值在1μg/mL，則對0.1μg/mL進行評估，以確認不會導致CD86超過陽性閾值的受試物的濃度；DMSO最終接觸濃度不得超過0.4%。選擇標準：至少2個濃度與前一次試驗相同；確認非細胞毒性下的最高CD86陰性濃度;確認所有非細胞毒性CD86陽性濃度；確認最低細胞毒性濃度；在EC150(或最高陰性非細胞毒性濃度)和CV70（或溶解度評估允許的最高濃度）之間均勻選擇其他所需濃度；若前兩次運行有差異，盡可能選擇多的共同濃度；若存在干擾，需重新選擇陽性濃度。6.3對照物處理培養(yǎng)基對照、溶劑對照（與受試物同法稀釋）、陽性對照松香酸（DMSO溶解，最終濃度50μg/mL）、陰性對照LA（完全培養(yǎng)基溶解，最終濃度200μg/mL），每種對照需要準備三對復孔。6.4細胞鋪板及染毒以3x105個/mL細胞傳代培養(yǎng)2天或以1.5x105個/mL傳代培養(yǎng)3天后，調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL，取100μL/孔受試物工作液和100μL/孔細胞懸液1:1混合接種于96孔無菌平板中，每種條件下一對復孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgG1同型對照染色。每次CD86表達檢測均需設置培養(yǎng)基對照、溶劑對照、陽性對照、陰性對照各三對復孔（當使用培養(yǎng)基作為溶劑時，溶劑對照與培養(yǎng)基相同），用密封帶蓋住板，在37±2°C，5±1%CO2，≥95%濕度下培養(yǎng)孵育45h±3h。6.5CD86表達檢測孵育結(jié)束后，檢查并確定溶解度（若在顯微鏡下觀察到晶體或液滴，則會產(chǎn)生干擾）。用排槍將細胞吹兩下從96孔平板對應移至V型板中，離心棄上清；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重懸細胞；用7-AAD染色細胞（5μL/孔，10min室溫，避光）；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重新懸浮細胞；用FITC標記的抗CD86或小鼠IgG1（5μL/孔，30min，4°C，避光）染色細胞；用100μL冰冷染色緩沖液清洗兩次；用100μL冰冷PBS清洗一次；在冰冷PBS中再懸浮細胞（96孔板中100μL或流式管中200μL）。注意：整個染色操作應在冰上進行，在每一個洗滌步驟中，不要通過反復的移液來重懸細胞，而是在棄去上清液后通過短暫的渦旋來分散細胞即可。用流式細胞儀對每組細胞的細胞存活率及CD86陽性細胞百分比進行測定。分別用以下用公式計算出受試物的細胞存活率（CV70）和受試物的細胞刺激指數(shù)（S.I.）。CV70=C1+V1：大于70%最小細胞活性值V2：小于70%最大細胞活性值C1（μg/mL）：V1對應的受試物濃度C2（μg/mL）：V2對應的受試物濃度S.I.=CD86+%：CD86陽性細胞百分比6.6流式細胞儀檢測繪制SSC/FSC散點圖，調(diào)節(jié)儀器電壓，圈出U937細胞群P1門；繪制7-AAD直方圖，圈出活細胞P2門；繪制FITC/SSC散點圖，放置十字門，分析細胞表面標記物CD86的表達。通過獲取完全培養(yǎng)基/IgG1孔表達值，設置FITC/SSC十字門分析標記，以便在可能的情況下，所有三個或至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1位于0.6至0.9%區(qū)域內(nèi)；如果這無法實現(xiàn)，則設置分析標記，使一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.6至0.9%，另一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.9%至1.5%；如果這仍然無法實現(xiàn)，則IgG1數(shù)據(jù)分布太廣，必須放棄運行。之后在不移動分析標記的情況下，測量每個孔中IgG1陽性細胞或CD86陽性細胞的百分比。細胞顯示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散點圖中，設置為對數(shù)比例（Log），以便清楚地識別第一門R1門中的（population）細胞群和消除碎片。設置流式細胞儀，每孔獲得P1門細胞10000個或包括死亡細胞在內(nèi)的多達20,000個細胞，或在分析開始后1min內(nèi)獲取數(shù)據(jù)。7結(jié)果評價7.1試驗成立條件7.1.1完全培養(yǎng)基對照細胞平均存活率>90%；至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1≥0.6且<1.5%；若丟棄一個完全培養(yǎng)基對照的離群值后，剩下的兩個完全培養(yǎng)基對照的校正后的CD86表達值應高于或低于其平均值的25%；完全培養(yǎng)基對照校正后的CD86基礎表達值≥2%且≤25%。7.1.2DMSO溶劑對照的平均存活率>90%；若丟棄一個DMSO對照的異常值后，剩下的兩個DMSO對照的校正后的CD86表達值應高于或低于其平均值的25%；丟棄異常值后，DMSO溶劑對照CD86S.I.的平均值小于250%。7.1.3陽性對照三對復孔中至少兩個為陽性（CD86S.I.≥150），必要時配制陽性對照系列濃度，應存在劑量反應。7.1.4陰性對照三對復孔中至少有兩個為陰性（CD86S.I.<150%），且細胞活性≥70%。7.1.5溶解度干擾：受試物處理后45±3h(細胞染色前)在顯微鏡下觀察到晶體或滴狀，則提示測試受到受試物溶解度干擾。7.1.6顏色干擾：受試物FITC標記IgG1散點圖如發(fā)生位置偏移，則提示測試受到受試物顏色干擾（IgG1熒光通道幾何平均數(shù)S.I.≥150%）。7.2致敏性結(jié)果判定每種受試物至少進行兩次獨立的CD86表達檢測試驗。每種受試物表達檢測試驗，如果CD86S.I.僅在最高非細胞毒性濃度下高于150%，則在第一次試驗中無法判定。每次表達檢測試驗，如果CD86S.I.在所有非細胞毒性濃度下低于150%，且無干擾（溶解度、顏色、細胞毒性），則該次CD86表達判定為陰性；如果CD86S.I.高于150%，不論有無劑量反應和/或干擾，則該次CD86表達均判定為陽性。如果兩次試驗CD86表達結(jié)果一致，則可判定該受試物是否具有致敏性；如果兩次試驗CD86表達不具有一致性，則需進行第三次試驗。如果第一次試驗無法判定，第二次與第三次結(jié)果不一致，則需進行第四次試驗。最終的預測將基于三次或四次單獨運行的結(jié)果來綜合判定。7.3有效作用濃度計算對于判定具有致敏性的物質(zhì)，進一步計算其有效作用濃度值（EffectiveConcentratio