牙膏中微生物檢驗(yàn)方法總則菌落總數(shù)耐熱大腸菌群銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌霉菌和酵母菌總數(shù)檢驗(yàn)方法

11.牙膏中微生物檢驗(yàn)方法總則12.牙膏中菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法13.牙膏中耐熱大腸菌群檢驗(yàn)方法14.牙膏中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法15.牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法16.牙膏中霉菌和酵母菌總數(shù)檢驗(yàn)方法\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件1.doc"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件1.doc\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件2.doc"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件2.doc\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件3.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件3.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件4.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件4.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件5.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件5.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件6.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件6.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件7.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件7.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件8.doc"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件8.doc\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件9.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件9.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件10.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件10.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件11.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件11.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件12.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件12.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件13.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件13.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件14.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件14.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件15.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件15.docx\o"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件16.docx"國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2024年第13號(hào)通告附件16.docx附件11牙膏中微生物檢驗(yàn)方法總則GeneralGuidelinesinToothpaste1范圍本部分規(guī)定了牙膏微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。 本部分適用于牙膏樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2儀器和設(shè)備2.1天平：0~200g，精確至0.1g。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶：250mL、150mL。2.5玻璃珠。2.6無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。2.7均質(zhì)器。2.8滅菌均質(zhì)袋。3培養(yǎng)基和試劑3.1SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加熱溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.2~7.3分裝，每瓶90mL，121℃高壓滅菌20min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25℃左右使用。注：如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。4樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批牙膏規(guī)格大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從不少于2個(gè)包裝單位的樣品中共取10g。包裝量小于20g的樣品，采樣時(shí)可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。4.2供檢樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開，防止樣品被污染。4.3接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)置于陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。4.4若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其他分析。4.5在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在符合生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。5供檢樣品的制備稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mLSCDLP液體培養(yǎng)基（或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證等效或優(yōu)于SCDLP的稀釋液）三角瓶中，充分振蕩混勻，作為1:10的檢液。使用均質(zhì)器時(shí)，則采用滅菌均質(zhì)袋，稱10g樣品加入90mLSCDLP液體培養(yǎng)基（或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證等效或優(yōu)于SCDLP的稀釋液），均質(zhì)1min~2min，充分混勻后，作為1:10的檢液。附件12牙膏中菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法AerobicPlateCountinToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于牙膏中菌落總數(shù)的測(cè)定。2定義2.1菌落總數(shù)Aerobicplatecount牙膏檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等）培養(yǎng)后，1g檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。所得結(jié)果包括本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫需氧菌和兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3儀器和設(shè)備3.1三角瓶：250mL。3.2量筒：200mL。3.3pH計(jì)或精密pH試紙。3.4高壓滅菌器。3.5試管：18mm×150mm。3.6滅菌平皿：直徑90mm。3.7無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.8酒精燈。3.9恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.10放大鏡。3.11恒溫水浴箱。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則3.1。4.2卵磷脂、吐溫80—營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH值為7.1~7.4，加入瓊脂，121℃高壓滅菌20min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.30.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenylterazoliumchloride，TTC）成分：TTC0.5g蒸餾水100mL制法：溶解后過(guò)濾除菌，或115℃高壓滅菌20min，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。5操作步驟5.1用滅菌吸管吸取1:10的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mLSCDLP液體培養(yǎng)基（或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證等效或優(yōu)于SCDLP的稀釋液）試管中（注意勿使吸管接觸液面），并充分混勻，制成1:100檢液，更換一支吸管，吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。樣品至少需進(jìn)行1:10和1:100稀釋，如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每個(gè)稀釋度應(yīng)換1支吸管。5.2將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使檢液與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。同時(shí)吸取1mL空白稀釋液加入滅菌空平皿中，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h，為空白對(duì)照。5.3為便于區(qū)別牙膏中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而牙膏的顆粒顏色無(wú)變化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用5倍~10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。7菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1首先選取平均菌落數(shù)在30~300之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例1）。7.2若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30~300之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例2及例3）。7.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例4）。7.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1例5）。7.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一個(gè)稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例6）。7.6若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g小于10CFU。7.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表1報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)10-110-210-3兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù)（CFU/g）報(bào)告方式（CFU/g）1136516420─1640016000或1.6×10422760295461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可計(jì)4650513─513000510000或5.1×105527115─270270或2.7×1026不可計(jì)30512─3050031000或3.1×1047000─＜1×10＜10注：CFU-菌落形成單位。7.8以CFU/g為單位報(bào)告。附件13牙膏中耐熱大腸菌群檢驗(yàn)方法DetectionofThermotolerantColiformBacteriainToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗(yàn)。2定義2.1耐熱大腸菌群Thermotolerantcoliformbacteria系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24h～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌主要來(lái)自人和溫血?jiǎng)游锛S便，可作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)牙膏的衛(wèi)生質(zhì)量,推斷牙膏中有否污染腸道致病菌的可能。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44.5℃±0.5℃。3.2溫度計(jì)。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電磁爐。3.7三角瓶：250mL。3.8試管：18mm×150mm。3.9小倒管。3.10pH計(jì)或pH試紙。3.11高壓滅菌器。3.12無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.13滅菌平皿：直徑90mm。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則3.1。4.2雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫8014g蒸餾水1000mL制法：將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào)pH為7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管，每管10mL（每支試管中加一個(gè)小倒管）。115℃高壓滅菌20min。4.3伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍(lán)水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀和蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000mL。調(diào)pH值為7.2~7.4，分裝于三角瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中無(wú)菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL0.5%美藍(lán)水溶液，搖勻，冷至45℃~50℃，傾注平皿備用。4.4蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗(yàn)用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.0~7.2，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。4.5靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL~0.5mL，輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.6革蘭氏染色液：4.6.1染液制備結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。脫色液：95%乙醇。復(fù)染液：（1）沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。（2）稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100mL，放置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.6.2染色法將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脫色，約30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s，水洗。滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。4.6.3染色結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需10s。5操作步驟5.1取10mL1:10的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為耐熱大腸菌群陰性。5.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液1~2滴接種到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。耐熱大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。5.5如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，可從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取經(jīng)純化的可疑菌落，用無(wú)菌稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告經(jīng)上述檢驗(yàn)步驟，若發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性無(wú)芽胞短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。附件14牙膏中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法DetectionofPseudomonasAeruginosainToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)。2定義銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，大部分能產(chǎn)生綠膿菌素。3儀器3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、42℃±1℃。3.2三角瓶：250mL。3.3試管：18mm×150mm。3.4滅菌平皿：直徑90mm。3.5無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針、接種環(huán)。3.9電磁爐。3.10高壓滅菌器。3.11恒溫水浴箱。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則3.1。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4~7.6，加入瓊脂，115℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.3乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無(wú)水磷酸氫二鉀1.39g無(wú)水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）0.5g酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學(xué)純）10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調(diào)pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，115℃高壓滅菌20min后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min，隨時(shí)攪拌加熱使之溶解，調(diào)pH至7.4，分裝于試管內(nèi)，經(jīng)115℃高壓滅菌20min后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過(guò)濾后補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.2~7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌20min后，制成斜面?zhèn)溆谩?操作步驟5.1增菌培養(yǎng)：取1:10檢液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。5.2分離培養(yǎng)：將增菌后的培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將增菌后的培養(yǎng)物劃線接種于平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基呈紅色，其他菌不生長(zhǎng)。5.3純化：挑取可疑菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上純化，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。5.4染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色（見(jiàn)牙膏中耐熱大腸菌群檢驗(yàn)方法4.6.2），鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。5.5氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在15s~30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗(yàn)陰性。5.6綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落2個(gè)~3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內(nèi)，待三氯甲烷提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.7硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽(yáng)性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.8明膠液化試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液狀或表面液化時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；如凝固不溶者為陰性。5.942℃生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于42℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h~48h，銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。5.10如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，可從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取經(jīng)純化的可疑菌落，用無(wú)菌稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。6檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，平板上有可疑菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性，即可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而明膠液化、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。附件15牙膏中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法DetectionofStaphylococcusAureusinToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中金黃金色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于牙膏中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2定義金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀排列，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽(yáng)性。3儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.3離心機(jī)。3.4無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.5試管：18mm×150mm。3.6載玻片。3.7酒精燈。3.8三角瓶：250mL。3.9高壓滅菌器。3.10恒溫水浴箱。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.1。4.2營(yíng)養(yǎng)肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.37.5%氯化鈉肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH為7.4，分裝，121℃高壓滅菌15min。4.4BairdParker平板成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCl·6H2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH7.0±0.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃，調(diào)節(jié)pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過(guò)48h±2h。4.5血瓊脂平板成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50℃左右無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.6甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（115℃10lb）20min滅菌備用。4.7滅菌液體石蠟制法：取液體石蠟50mL，121℃高壓滅菌20min。4.8兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，121℃高壓滅菌30min，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm~3000rpm離心3min~5min。血球下沉，取上面血漿。5操作步驟5.1增菌：取1:10的檢液10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h±2h。5.2分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取1~2接種環(huán)，劃線接種到BairdParker平板上，如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無(wú)混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?，?6℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。5.3染色鏡檢：挑取血瓊脂平板上分純后的菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，排列成葡萄狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5mm~1mm。5.4甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取血瓊脂平板上分純后的菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2mm~3mm的滅菌液體石蠟，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取1:4新鮮血漿0.5mL