實驗03土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

專題03土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗原理：（1）土壤中的細菌之所以能分解尿素是因為它們能合成尿酶。（2）配置以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠在這個培養(yǎng)基上生長的細菌就是能分解尿素的細菌。操作步驟：(1)土壤取樣①土壤要求：酸堿度接近中性且潮濕。②取樣部位：距地表約3～8cm的土壤層。(2)樣品的稀釋測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養(yǎng)，當?shù)谝淮巫鲞@個實驗時可以將稀釋的范圍放寬一點。(3)微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)：根據(jù)不同微生物的需要，控制適宜的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。②觀察a．觀察方法：每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。b．記錄菌落的特征：包括菌落的形狀、大小和顏色等。2、滅菌培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌法3、培養(yǎng)皿滅菌：干熱滅菌法操作提示(1)無菌操作①取土樣的用具在使用前都需要滅菌。②實驗操作均應在酒精燈火焰旁進行。(2)做好標記：本實驗使用的平板和試管較多，為避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養(yǎng)皿時應該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。(3)制定計劃：對于耗時較長的生物實驗，需要事先規(guī)劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)操作中需注意的問題(1)為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。(2)恰當?shù)南♂尪仁浅晒y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。(3)為增強實驗說服力與準確性，設(shè)計實驗時，需要涂布至少三個平板作為重復組，目的是排除實驗中偶然因素對實驗結(jié)果的影響。(4)分析實驗結(jié)果時，要考慮重復組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。(5)為防止培養(yǎng)時間不足導致菌落遺漏，在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。(6)統(tǒng)計的菌落數(shù)目往往比活菌的實際數(shù)目少。1．（2023·山東·高考真題）平板接種常用在微生物培養(yǎng)中。下列說法正確的是（

）A．不含氮源的平板不能用于微生物培養(yǎng)B．平板涂布時涂布器使用前必須進行消毒C．接種后未長出菌落的培養(yǎng)基可以直接丟棄D．利用以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物【答案】D【分析】1、培養(yǎng)基是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。2、按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。3、消毒和滅菌是兩個不同的概念，消毒是指使用較為溫和的物理、化學或生物的方法殺死物體表面或內(nèi)部的一部分微生物。滅菌則是指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子?！驹斀狻緼、不含氮源的平板可用于固氮菌的培養(yǎng)，A錯誤；B、平板涂布時涂布器使用前必須浸在酒精中，然后在火焰上灼燒滅菌，這種操作屬于滅菌，不屬于消毒，B錯誤；C、使用后的培養(yǎng)基即使未長出菌落也要在丟棄前進行滅菌處理，不能直接丟棄，以免污染環(huán)境，C錯誤；D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素為唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素獲得氮源而進行生長繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而無法生長，因此以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物，D正確。故選D。2．（2022·江蘇·統(tǒng)考高考真題）下列是某同學分離高產(chǎn)脲酶菌的實驗設(shè)計，不合理的是（

）A．選擇農(nóng)田或公園土壤作為樣品分離目的菌株B．在選擇培養(yǎng)基中需添加尿素作為唯一氮源C．適當稀釋樣品是為了在平板上形成單菌落D．可分解酚紅指示劑使其褪色的菌株是產(chǎn)脲酶菌【答案】D【分析】為了篩選可分解尿素的細菌，配制的培養(yǎng)基應選擇尿素作為唯一氮源，含脲酶的微生物在該培養(yǎng)基上能生長，其它微生物在該培養(yǎng)基上因缺乏氮源而不能生長，可用于分離含脲酶的微生物?！驹斀狻緼、農(nóng)田或公園土壤中含有較多的含脲酶的微生物，A正確；B、為了篩選可分解尿素的細菌，配制的培養(yǎng)基應選擇尿素作為唯一氮源，含脲酶的微生物在該培養(yǎng)基上能生長，B正確；C、當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，C正確；D、在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的pH升高，酚紅指示劑將變紅，因此在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，能對分離的菌種做進一步鑒定，D錯誤。故選D。3．（2022·湖南·高考真題）黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發(fā)酵酒。發(fā)酵酒的釀造過程中除了產(chǎn)生乙醇外，也產(chǎn)生不利于人體健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素與乙醇反應形成，各國對酒中的EC含量有嚴格的限量標準。回答下列問題:(1)某黃酒釀制工藝流程如圖所示，圖中加入的菌種a是，工藝b是（填“消毒”或“滅菌”），采用工藝b的目的是。(2)以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入指示劑，根據(jù)顏色變化，可以初步鑒定分解尿素的細菌。尿素分解菌產(chǎn)生的脲酶可用于降解黃酒中的尿素，脲酶固定化后穩(wěn)定性和利用效率提高，固定化方法有（答出兩種即可）。(3)研究人員利用脲酶基因構(gòu)建基因工程菌L，在不同條件下分批發(fā)酵生產(chǎn)脲酶，結(jié)果如圖所示。推測是決定工程菌L高脲酶活力的關(guān)鍵因素，理由是。(4)某公司開發(fā)了一種新的黃酒產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)EC含量超標。簡要寫出利用微生物降低該黃酒中EC含量的思路?！敬鸢浮?1)酵母菌消毒目的是殺死啤酒的中大多數(shù)微生物，并延長其保存期(2)酚紅化學結(jié)合法、包埋法、物理吸附法(3)pH兩圖中脲酶活力隨時間變化的曲線基本一致，而維持pH在6.5不變與pH從6.5降為4.5相比較而言，酶活力值始終要高(4)方案一：配置一種選擇培養(yǎng)基，篩選出產(chǎn)生EC降解酶的細菌，從細菌中分離得到EC降解酶，純化的EC降解酶進行固定化操作后，加入該黃酒中。方案二：配置一種選擇培養(yǎng)基，篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌，從細菌中分離得到脲酶，純化的脲酶進行固定化操作后，在黃酒工藝流程的發(fā)酵環(huán)節(jié)中加入?！痉治觥坑捎诩毦纸庠谀蛩氐倪^程中合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，可在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，尿素被分解后產(chǎn)生氨，pH升高，指示劑變紅。【詳解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的無氧呼吸，加入的菌種a是酵母菌。過濾能除去啤酒中部分微生物，工藝b是消毒，目的是殺死啤酒的中大多數(shù)微生物，并延長其保存期。（2）由于細菌分解尿素的過程中合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，故在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑可以鑒別尿素分解菌。固定化酶實質(zhì)上是將相應酶固定在不溶于水的載體上，實現(xiàn)酶的反復利用，并提高酶穩(wěn)定性，酶的各項特性（如高效性、專一性和作用條件的溫和性）依然保持。固定化酶的方法包括化學結(jié)合法、包埋法、物理吸附法等。（3）對比兩坐標曲線，兩圖中脲酶活力隨時間變化的曲線基本一致，說明培養(yǎng)時間不是決定因素；而維持pH在6.5不變與pH從6.5降為4.5相比較而言，酶活力值始終要高，說明pH為6.5時，有利于酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，故pH是決定工程菌L高脲酶活力的關(guān)鍵因素。（4）從坐標圖形看，利用脲酶消除其前體物質(zhì)尿素可降低該黃酒中EC含量。配置一種選擇培養(yǎng)基，篩選出產(chǎn)生EC降解酶的細菌，從細菌中分離得到EC降解酶，純化的EC降解酶進行固定化操作后，加入該黃酒中?；蛘吲渲靡环N選擇培養(yǎng)基，篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌，從細菌中分離得到脲酶，純化的脲酶進行固定化操作后，在黃酒工藝流程的發(fā)酵環(huán)節(jié)中加入。1．如下圖為研究人員從紅棕壤中篩選高效分解尿素細菌的意圖，有關(guān)敘述不正確的是（

）A．步驟③純化分解尿素的細菌的原理是將聚集的細菌分散，以獲得單細胞形成的菌落B．配制步驟②、③的培養(yǎng)基都要進行嚴格滅菌C．步驟④挑?、壑胁煌N的菌落分別接種，比較細菌分解尿素的能力D．步驟③采用涂布平板法接種，并需向牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入尿素【答案】D【分析】從紅棕壤中篩選高效分解尿素細菌過程：（1）利用紅棕壤和無菌水制備紅棕壤浸出液；（2）取上清液2mL放在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（3）可用移液器取1mL菌液放在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中進行分離單菌落，篩選、純化分解尿素的細菌；（4）挑選單菌落接種于尿素液體培養(yǎng)基，進行鑒定分解尿素的能力?！驹斀狻緼、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，利用涂布分離法將聚集的細菌分散，以獲得單細胞形成的菌落是純化分解尿素的細菌的原理，A正確；B、配制步驟②、③的培養(yǎng)基時，為防止雜菌污染，應進行嚴格滅菌，B正確；C、經(jīng)過③篩選、純化分解尿素的細菌，但不同菌分解尿素的能力不同，因此需要挑取③中的不同種的菌落接種于④中，比較細菌分解尿素的能力，C正確；D、要篩選出能高效分解尿素的細菌，所選用的培養(yǎng)基要以尿素為唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨中都含有氮源，因此步驟③所用的培養(yǎng)基中不能含有牛肉膏、蛋白胨，D錯誤。故選D。閱讀下列材料，回答下列題。當培養(yǎng)基以尿素為唯一氮源時，只有能分泌脲酶的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長，利用這種培養(yǎng)基就可分離出土壤中能產(chǎn)生脲酶的微生物。微生物利用脲酶分解尿素產(chǎn)生的氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈紅色，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)紅色區(qū)域，就可進一步鑒定尿素分解菌。2．尿素分解菌能在只有尿素作為氮源的尿素固體培養(yǎng)基中生長，其直接利用的氮源是（

）A．尿素 B．氨 C．脲酶 D．蛋白胨3．在進行“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”活動時，用來判斷培養(yǎng)基是否發(fā)揮選擇作用的對照組是（

）A．未接種的選擇培養(yǎng)基 B．已接種的選擇培養(yǎng)基C．未接種的全營養(yǎng)培養(yǎng)基 D．已接種的全營養(yǎng)培養(yǎng)基【答案】2．B3．D【分析】在培養(yǎng)基中添加（或減去）某種化學成分，使得只有某些特定的微生物能夠生長，其他微生物均不能生長，這樣的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。如在培養(yǎng)基中添加了青霉素后，只有對青霉素有抗性的細菌才能生長，對青霉素敏感的細菌則不能生長。而在不添加任何氮源的培養(yǎng)基上，只有能固氮的微生物才能生長。使用選擇培養(yǎng)基能從混雜的微生物群體中快速篩選出所需種類的目標微生物，也可以從已知種類的混雜的細胞群體中篩選出特定的細胞。2．題干信息：能分泌脲酶的微生物利用脲酶分解尿素產(chǎn)生的氨，故尿素分解菌能在只有尿素作為氮源的尿素固體培養(yǎng)基中生長，其直接利用的氮源是氨，ACD錯誤，B正確。故選B。3．實驗遵循單一變量和對照原則，實驗：進行“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”活動，該實驗使用的培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基，故用來判斷培養(yǎng)基是否發(fā)揮選擇作用的對照組是已接種的全營養(yǎng)培養(yǎng)基，ABC錯誤，D正確。4．幽門螺桿菌(含有脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進行分離培養(yǎng)。下列有關(guān)敘述正確的是（

）A．分離純化幽門螺桿菌時應使用以尿素為唯一氮源、pH為中性的培養(yǎng)基B．進行幽門螺桿菌培養(yǎng)需要提供95%空氣和5%CO2的氣體環(huán)境C．可采用稀釋涂布平板法對幽門螺桿菌進行分離和計數(shù)D．鑒別幽門螺桿菌時應在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑【答案】ACD【分析】1、脲酶可以將尿素分解成二氧化碳和氨氣。2、分離純化細菌的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法?！驹斀狻緼、幽門螺桿菌可以合成脲酶，可以利用尿素，所以分離純化幽門螺桿菌時應使用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，幽門螺桿菌屬于細菌，培養(yǎng)時可將培養(yǎng)基pH調(diào)至中性，A正確；B、需要提供95%空氣（含有氧氣，利于細胞進行呼吸）和5%CO2（維持培養(yǎng)液的pH）的氣體環(huán)境進行培養(yǎng)的是動物細胞而非幽門螺桿菌（在培養(yǎng)基中培養(yǎng)而非培養(yǎng)液），B錯誤；C、稀釋涂布平板法可以用于微生物的分離和計數(shù)，因此對幽門螺桿菌進行分離和計數(shù)可采用稀釋涂布平板法，C正確；D、由于幽門螺桿菌在分解尿素的過程中會合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，即在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，尿素被分解后產(chǎn)生氨，pH升高，則該菌落周圍會出現(xiàn)紅色環(huán)帶，故鑒別幽門螺桿菌時應在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，D正確。故選ACD。5．為了分離和純化高效分解石油的細菌，科研人員利用被石油污染過的土壤進行下圖A所示的實驗。同學甲進行步驟④的操作，其中一個平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如圖B所示。同學乙也按照同學甲的接種方法進行了步驟④的操作：將1mL樣品稀釋100倍，在5個培養(yǎng)基平板上分別接入0.1mL稀釋液，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的細菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，無菌落產(chǎn)生。下列敘述正確的是（

）A．乙同學計算得出每升樣品中的活菌數(shù)約為3.3×108個B．步驟③與步驟②中培養(yǎng)基成分的最大區(qū)別是步驟③的培養(yǎng)基中石油是唯一碳源C．步驟④甲同學出現(xiàn)圖B結(jié)果可能的操作失誤是樣品的稀釋程度太低導致D．步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是篩選出能分解石油的細菌【答案】B【分析】1、實驗室中微生物的篩選，可以人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基，本題中③為以石油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，能分解石油的細菌可以生長。2、稀釋涂布平板法除可以用于分離微生物外，也常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)為30~300的平板進行計數(shù)?！驹斀狻緼、乙同學實驗平板上長出的細菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191，數(shù)據(jù)之間差值過大，應分析誤差產(chǎn)生的原因，重新進行實驗，不能這些數(shù)值去計算，A錯誤；B、該實驗的目的是為了分離和純化高效分解石油的細菌，因此步驟③是以石油是唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，與步驟②中培養(yǎng)基成分相比，最大的區(qū)別是石油是唯一碳源，B正確；C、步驟④甲同學出現(xiàn)圖B結(jié)果是菌落分布不均勻，可能的操作失誤是用涂布器涂布平板時涂布不均導致，C錯誤；D、步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是篩選出能高效分解石油的細菌，D錯誤。故選B。6．自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數(shù)量的測定。下面是有關(guān)土壤中分解尿素的細菌分離和計數(shù)的實驗過程，請回答有關(guān)問題。(1)為分離出土壤中分解尿素的細菌，應該用的培養(yǎng)基進行分離。(2)若取土樣6g，應加入mL的無菌水配制成稀釋10倍土壤溶液。因土壤中細菌密度很大，需要不斷加以稀釋，配制成101～107不同濃度的土壤溶液。將103～107倍的稀釋液分別吸取0.2mL加入到固體培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液鋪平，每個稀釋度下至少涂布3個平板。將接種的培養(yǎng)皿放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，觀察并統(tǒng)計菌落數(shù)，結(jié)果如下表，其中倍的稀釋比較合適，由此計算出每克土壤中的菌落數(shù)為。稀釋倍數(shù)103104105106107菌落數(shù)（個）1號平板4783672702652號平板4963542642083號平板509332252293(3)若研究尿素分解菌的群體生長規(guī)律，可采用平板劃線法分離土壤中的尿素分解菌。操作時，接種環(huán)通過灼燒滅菌，在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是。將分離純化后的單個菌落進行液體培養(yǎng)，可采用定期取樣的方法進行計數(shù)。若以一個大方格（體積為0.1mm3）有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算，設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為50，菌液稀釋倍數(shù)為102，那么原菌液的菌群密度為個/mL?！敬鸢浮?1)尿素作為唯一的氮源(2)541051.31×108(3)將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得（不連續(xù)）單個菌落2.5×108【分析】篩選尿素分解菌需要使用尿素為唯一的氮源的選擇培養(yǎng)基，尿素分解菌可以使用酚紅指示劑進行鑒定；稀釋涂布平板法接種可以用來進行微生物的計數(shù)；利用稀釋涂布平板發(fā)估算樣品中活菌數(shù)時，往往選擇菌落數(shù)在30300之間的平板。【詳解】（1）為了純化分解尿素的細菌，需要抑制其他雜菌的生長，所以需要使用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)。（2）將土壤稀釋10倍是指土壤占混合液的10%，所以土壤溶液總量應為60ml，故需要添加54ml的無菌水；估算樣品中活菌數(shù)時，往往選擇菌落數(shù)在30300之間的平板，所以稀釋倍數(shù)為105時效果最佳；每克土壤中的菌落數(shù)需先算出三個平板的平均數(shù)，再除以滴加量，最后乘稀釋倍數(shù)，（270+264+252）÷3÷0.2×105=1.31×108。（3）利用平板劃線法分離土壤中的尿素分解菌時，接種環(huán)通過灼燒滅菌，在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線，這樣做每次重新畫線菌的數(shù)量都會在原有基礎(chǔ)上下降，越來越少，最終將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得（不連續(xù)）單個菌落；若以一個大方格（體積為0.1mm3）有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算，設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為50，菌液稀釋倍數(shù)為102，那么原菌液的菌群密度為50×5÷0.1×103×102=2.5×108個/mL。7．尿素[CO(NH2)2]是有機態(tài)氮肥，只有在被土壤中的微生物分解后，才能被農(nóng)作物吸收和利用。某興趣小組試圖從土壤中分離能分解尿素的細菌，相關(guān)流程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)為了分離得到尿素分解菌，需要配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入的尿素能為微生物提供的營養(yǎng)成分是。(2)配制好的培養(yǎng)基，采用法進行滅菌，待平板冷卻凝固后需要將平板（填放置方式），這樣做的目的是（答出1點）。(3)據(jù)圖分析，該興趣小組設(shè)置了三個培養(yǎng)皿進行接種，所采用的接種方法是，培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)過統(tǒng)計，在培養(yǎng)基表面分別形成了51、42、45個菌落，據(jù)此計算，1g土壤樣品中約有分解尿素的細菌