《2012 clsi及eucast更新要點(diǎn)及替加環(huán)素藥敏測定難點(diǎn)解析》

2012CLSI及EUCAST更新要點(diǎn)及替加環(huán)素藥敏測定難點(diǎn)解析

2012.7.25

四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室黃湘寧1.CLSIM100-S22更新要點(diǎn)2.2012更新要點(diǎn)1.腸桿菌科再次修訂厄他培南的折點(diǎn)增加環(huán)丙沙星對傷寒沙門菌及腸道外沙門菌分離株的折點(diǎn)2.銅綠假胞菌降低哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸的折點(diǎn)降低亞胺培南、美羅培南的折點(diǎn)；增加多尼培南折點(diǎn)3.葡萄球菌屬增加青霉素紙片抑菌圈邊緣法檢測β內(nèi)酰胺酶。New!3.CLSIDocumentMIC(μg/ml)DiskDiffusion(mm)SuscIntResSuscIntResM100-S20(Jan.2010)*≤24≥8≥1916-18≤15M100-S20U(June2010)≤0.250.5≥1≥2320-22≤19M100-S22(Jan2012)**≤0.51.0≥2≥2219-21≤181.腸桿菌科

厄他培南CLSI折點(diǎn)更新過程*目前和FDA折點(diǎn)相同NewNew!4.1.腸桿菌科

為什么CLSI再次修訂腸桿菌科對厄他培南的折點(diǎn)？2011折點(diǎn)主要基于：MIC分布PK/PD（保守的≤0.25μg/ml

）非常有限的臨床數(shù)據(jù)（無MICs＝0.5μg/ml

）2012折點(diǎn)主要基于：增加的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示分離株MICs＝0.5μg/ml

但不產(chǎn)生碳青霉烯酶進(jìn)一步回顧了PK/PD增加了臨床數(shù)據(jù)（包括產(chǎn)ESBL大腸埃希菌其MICs＝0.5μg/ml提示臨床有效）同時，一些商品化藥敏組合中厄他培南的最低濃度是0.5μg/ml，這樣允許實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)證后可直接應(yīng)用CLSI折點(diǎn)。5.1.腸桿菌科

ModifiedHodgeTest(MHT)

(Table2ASupplementalTable2and3)

M100-S22.P52－60“NOTE:Notallcarbapenemase-producingisolatesofEnterobacteriaceaeareMHTpositiveandMHT-positiveresultsmaybeencounteredinisolateswithcarbapenemresistancemechanismsotherthancarbapenemaseproduction.”備注：并不是所有產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌MHT均為陽性，有些菌株MHT陽性但對碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制并不一定是產(chǎn)碳青霉烯酶。6.什么時候做MHT？M100M100--S222.Comment(23)Page47.Table2ASupplemeentalTables2and3.Pages52and56.做MHT碳青霉烯酶篩查陽性流行病學(xué)需要如果使用新的折點(diǎn)如果使用舊的折點(diǎn)做MHT7.1.腸桿菌科

環(huán)丙沙星新、舊折點(diǎn)比較DD(mm)MIC(μg/ml)SuscIntResSuscIntRes≥2116--20≤15≤12≥4OrganismDD(mm)MIC(μg/ml)SusccIntResSuscIntResEnterobacteriaceaeotherthanS.typhiandextraintestinalSSalmonellaspp.≥2116--20≤15≤12≥4S.typhiandextraintestinalSalmonellaspp.≥3121--30≤20≤0.060.12--0.5≥1M100-S21,P46M100-S22,P48New!8.1.腸桿菌科

傷寒沙門菌及腸道外沙門菌環(huán)丙沙星藥敏試驗(yàn)最好做環(huán)丙沙星MIC自動化藥敏儀器無法給出新折點(diǎn)的最低稀釋度——考慮用E-Test?如果用紙片擴(kuò)散法，考慮同時做萘啶酸和環(huán)丙沙星紙片萘啶酸對gyrA酶突變菌株檢出效果好環(huán)丙沙星對質(zhì)粒編碼的基因突變的菌株檢出效果好染色體介導(dǎo)的gyrA酶基因突變比質(zhì)粒編碼的基因突變致氟喹諾酮敏感性降低更常見。其它氟喹諾酮（如左氧）折點(diǎn)仍在評估中。9.1.腸桿菌科

沙門菌推薦報告哪些藥物？“對于分離自糞便的沙門菌或志賀菌，僅常規(guī)測試并報告氨芐西林、一種氟喹諾酮類藥物和復(fù)方新諾明。另外，對于分離自腸道外的沙門菌，增加測試并報告一種三代頭孢菌素，如有需要亦測試并報告氯霉素藥敏結(jié)果。”M100-S22.P4410.1.腸桿菌科

糞便分離的沙門菌藥敏報告策略不常規(guī)報告AST，除非是門診病人沙門菌病通常是自限性疾病不常規(guī)推薦進(jìn)行抗生素治療在一些情況特殊的病人（如免疫功能受抑、HIV）與醫(yī)生討論是否需要做AST保守地，要考慮強(qiáng)調(diào)更低的環(huán)丙沙星折點(diǎn)。11.1.腸桿菌科

腸道外分離的沙門菌藥敏報告策略做藥敏試驗(yàn)環(huán)丙沙星使用新的折點(diǎn)病人伴隨出現(xiàn)分離株的應(yīng)用自糞便分離株的報告策略。12.2.銅綠假單胞菌折點(diǎn)(ug/ml)修訂AgentOld(M100-(M100-S21)NewM100M100--S22SuscIntResSuscIntRes哌拉西林≤64-≥128≤1632--64≥128哌拉西林－他唑巴坦≤64/4-≥128/4≤16/432/4--64/4≥128/4替卡西林≤64-≥128≤1632--64≥128替卡西林－克拉維酸≤64/2-≥128/2≤16/232/2--64/2≥128/2New!對應(yīng)紙片擴(kuò)散法的折點(diǎn)亦修訂。M100-S22,P6313.2.銅綠假單菌折點(diǎn)修訂AgentOld(M100-(M100-S21)NewM100M100--S221SuscIntResSuscIntRes

Doripenem2≤24≥8

Imipenem3≤48≥16≤24≥8

Meropenem3≤48≥16≤24≥81、對應(yīng)紙片擴(kuò)散法的折點(diǎn)亦修訂。

2、Interpretivecriteriaarebasedondosageregimensof500mgevery8h3、Interpretivecriteriaarebasedondosageregimensof1gevery8hM100-S22.P63.14.3.葡萄球菌—青霉素>90%葡萄球菌對青霉素耐藥極少考慮用青霉素治療葡萄球菌所引起的感染(但在一些感染需要長期的治療,如:感染性心內(nèi)膜炎、骨關(guān)節(jié)炎,如果青霉素是敏感的話，可能考慮)一些葡萄球菌不論用MIC法或紙片法結(jié)果可為“S”，但仍可能產(chǎn)β—內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致青霉素治療失敗。15.Induced?-lactamaseTest苯唑西林(誘導(dǎo)劑)Subisolatetoagar(e.g.,BAP,MHA)Drop?-lactamdisk(e.g.,oxacillin,cefoxitin)IncubateovernightTestcellsfromperipheryofzoneIfβ-lactamasepositive(withorwithoutinduction),reportpenicillinRPosNeg16.β內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)頭孢硝塞酚β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)通常但不總是能檢出葡萄球菌的β內(nèi)酰胺酶；其它的β內(nèi)酰胺酶更為敏感：“三葉草”試驗(yàn)青霉素紙片法邊緣試驗(yàn)PCR檢測blaZ基因不是檢測β內(nèi)酰胺酶理想的方法blaZ編碼β內(nèi)酰胺酶blaZ基因有許多型17.CloverleafAssayforβ-lactamase

S.aureus5%sheepbloodagar1unitpenicillindiskS.aureusATCC25923astheindicatorβ-lactamasenegative(penicillinS)strainSomedifficultiesreadingIsolatesA-Dareallβ-lactamasepositiveABCDβ-lactamasenegative18.Staphylococcus

aureus

DiskZoneEdgeTest(10Upenicillindiskandstandarddiskdiffusionmethod)Fuzzy“beach”=β-lactamasenegativePenicillin-SSharp“cliff”=β-lactamasepositivePenicillin-RS.aureusQC:

Neg-ATCC25923Pos-ATCC29213(supplementalQC)M100-S22.Table2CSupplementalTable1.Page83.New!19.葡萄球菌—

青霉素藥敏可選擇的策略如青霉素“R”則報告如青霉素“S”則不報告，并增加備注“如需青霉素結(jié)果請聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室”如青霉素“S”并且需要其結(jié)果，應(yīng)做：對于金黃色葡萄球菌：頭孢硝塞酚β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)如陰性進(jìn)一步做青霉素抑菌圈邊緣試驗(yàn)對于CoNS（包括路鄧）誘導(dǎo)頭孢硝塞酚β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)繼續(xù)測試從病人后繼分離菌株的藥敏結(jié)果20.EUCAST（歐洲藥敏試驗(yàn)委員會）

—2012新點(diǎn)免費(fèi)網(wǎng)站：21.2011-2012做的工作1.折點(diǎn)表v2.0（2012年1月網(wǎng)上發(fā)表）2.技術(shù)規(guī)范v2.0（網(wǎng)上及CMI已發(fā)表）3.PK/PDinEUCAST（網(wǎng)上及CMI已發(fā)表）4.建立分會重要的耐藥機(jī)制5.發(fā)表了幾個指南、文件、SOPs、RDs6.EUCASTAFST（念珠菌、曲霉菌）7與EMA合作新藥鑒定：一種治療MRSA的藥物、幾種抗真菌藥物8.網(wǎng)站，增加了一些功能并有所改進(jìn)9.MIC/抑菌圈分布數(shù)據(jù)有增有減10.確定一些抑菌圈直徑的折點(diǎn)、網(wǎng)上已公布22.2011年四川省耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測情況23.多重耐藥菌的分布2010年四川省人民醫(yī)院多重耐藥菌分布情況24.結(jié)果分析（葡萄球菌屬）金葡（3495株）、凝固酶陰性葡萄球菌（1819株）藥物敏感率（S％）2011年四川省耐藥檢測網(wǎng)數(shù)據(jù)25.結(jié)果分析（腸球菌屬）

糞腸球菌（733株）、屎腸球菌（924株）對藥物敏感率S（%）2011年四川省耐藥檢測網(wǎng)數(shù)據(jù)26.結(jié)果分析銅綠假單胞菌（3702株）、鮑曼不動桿菌（3364株）對藥物敏感率（S％）27.2024/3/24四川省人民醫(yī)院2012年替加環(huán)素對常見多重耐藥菌體外抗菌活性研究（紙片擴(kuò)散法）28.研究方法：紙片擴(kuò)散法研究樣本：血液、尿液、痰液等樣本判斷標(biāo)準(zhǔn)：參照FDA批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)

腸桿菌科：敏感：≥19mm

中介：15-18mm

耐藥：≤14mm對不動桿菌，目前尚無批準(zhǔn)折點(diǎn)，本研究參照國外文獻(xiàn)敏感：≥16mm，耐藥：≤12mm

2024/3/2429.四川省人民醫(yī)院替加環(huán)素對G-菌敏感率（%）抗菌藥物大腸埃希菌肺炎克雷伯菌陰溝腸桿菌鮑曼不動桿菌#產(chǎn)ESBL(100株)非產(chǎn)ESBL(100株)產(chǎn)ESBL(50株)非產(chǎn)ESBL(50株)50株100株阿米卡星92.095.094.098.0-47.0亞胺培南100.0100.0100.0100.098.020.0美羅培南100.0100.0100.0100.098.0-哌拉西林/他唑巴坦96.098.084.097.084.020.0左氧氟沙星27.058.074.094.088.033.0替加環(huán)素100.0100.0100.0*（3）100.0*（1）100.0*（1）100.030.替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)

難點(diǎn)解析31.Tigecycline替加環(huán)素甘氨酰環(huán)素結(jié)構(gòu)與四環(huán)素藥物類似，四環(huán)素衍生物抗菌譜廣Gram-positive,Gram-negative,andanaerobicorganisms（MRSA）對銅綠假單胞菌無效適應(yīng)征（18歲及以上）成人復(fù)雜的皮膚及軟組織感染成人復(fù)雜的腹腔內(nèi)感染32.替加環(huán)素藥敏操作難點(diǎn)檢測方法對測定結(jié)果的影響藥物自身對測定結(jié)果的影響培養(yǎng)基對測定結(jié)果的影響菌種對測定結(jié)果的影響判定折點(diǎn)對測定結(jié)果的影響判讀結(jié)果時的注意事項(xiàng)33.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

測定MIC的常用方法宏量肉湯稀釋法：實(shí)驗(yàn)耗材消耗大；每次只完成少數(shù)菌株；結(jié)果判讀容易，結(jié)果準(zhǔn)確。微量肉湯稀釋法：實(shí)驗(yàn)材料消耗少；每次可以完成大量菌株；結(jié)果判讀容易；結(jié)果準(zhǔn)確；容易產(chǎn)生污染。瓊脂稀釋法：耗材消耗適中；藥物消耗較大；一次可以完成多株菌株；判讀結(jié)果繁瑣，需要經(jīng)過訓(xùn)練；MIC分布較微量肉湯稀釋法有右移。Etest法：操作簡單，結(jié)果易讀；成本較高，不適用于大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法：操作簡單，結(jié)果易讀；成本低廉；結(jié)果不準(zhǔn)確；一些藥物沒有判斷折點(diǎn)。34.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

不同測定方法的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的檢測方法。常規(guī)工作，科學(xué)研究，耐藥監(jiān)測被檢測菌株的數(shù)量種類和測定藥物的數(shù)量。人員，設(shè)備的配置了解不同實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果的局限和差異35.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

替加環(huán)素微量肉湯稀釋法和Etest法比較(VRE)TsaoSMetal.IntJAntimicrobAgents.2008Nov;32Suppl3:S184-7.36.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

替加環(huán)素微量肉湯稀釋法和Etest法比較streptococcusspp.TsaoSMetal.IntJAntimicrobAgents.2008Nov;32Suppl3:S184-7.37.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

瓊脂稀釋法檢測MIC與肉湯稀釋法檢測MIC結(jié)果差異倍數(shù)的菌株數(shù)量分布MIC（MHA）/MIC（MHB）（稀釋倍數(shù)）Aba（170株）IMP-resistantEnterobacterieacae（102株）8104228212367123240.51338.1.檢測方法對測定結(jié)果的影響

微量肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法的比較菌株不同折點(diǎn)下微量肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法的敏感性比較FDAEUCASTSIRSIRMRSA(759)100/95.1—/——/—100/97.5—/—0/2.5VRE(191)98.4/95.8—/——/—98.4/97.41.1/1.60.5/1.0E.coli(602)99.7/97.80.13/1.90.17/0.398.3/99.31.4/0.40.3/0.3K.pneumoniae(736)ESBL94.6/69.64.2/27.11.2/3.382.6/—12.0/—5.4/—A.baumannii(726)60.6/71.229.5/23.09.9/5.833.5/8.127.1/21.539.4/70.4AntimicrobAgentsChemother.2012Mar;56(3):1414-7.Epub2011Dec12.39.1.檢測方法對替加環(huán)素測定結(jié)果的影響紙片擴(kuò)散法不能用于厭氧菌對不動桿菌的檢測不是最佳選擇在Kpn中存在S/I難以區(qū)分的問題，應(yīng)慎重判定在折點(diǎn)邊緣區(qū)域的菌株E-test法、微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法CLSI推薦使用肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法作為體外藥敏檢測的參考方法研究顯示除Merck培養(yǎng)基外，使用Difco、Remel、BBL和Oxoid培養(yǎng)基，MHA檢測的MIC值均高于MHB。使用不同培養(yǎng)基得出的MIC存在差異。M.TorricoJClinMicrobiol.

2010June;

48(6):2243–2246.40.kpn、ecl和sma進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論：MHA、MHB與ETEST使用相同培養(yǎng)基時，ETEST結(jié)果高一個稀釋倍數(shù)以上。對于不動桿菌屬，用Etest檢測的MIC≥2mg/L的結(jié)果要認(rèn)真分析，因?yàn)橥ǔＧ闆r下，Etest檢測的MIC值在2-4mg/L時，肉湯稀釋法均為敏感。2010年C.James等報道，使用BD的MH培養(yǎng)基，Etest檢測的MIC結(jié)果比微量肉湯稀釋法高。因此，建議Etest檢測出TGC不敏感的菌株，應(yīng)再用肉湯稀釋法確認(rèn)TorricoMetal.JClinMicrobiol.2010Jun;48(6):2243-6.CasalM,etal.JAntimicrobChemother.2009Jul;64(1):69-72.CohenStuartJ,etal.AntimicrobAgentsChemother.2010Jun;54(6):2746-7.1.檢測方法對替加環(huán)素測定結(jié)果的影響41.2.藥物自身對測定結(jié)果的影響物理性質(zhì)溶解度，純度，粉末性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)見光分解，緩慢氧化42.2.藥物自身對測定結(jié)果的影響

藥物配制準(zhǔn)確稱量藥物，若藥物用量太少則可以配制高濃度儲液。濃度計(jì)算需準(zhǔn)確，需要考慮到藥物的效價溶解藥物要按照CLSI的推薦溶劑溶解43.水平放置，避免周圍氣流干擾建議稱量大于10mg，以保證稱量結(jié)果的準(zhǔn)確。（使用小面積紙稱量）稱量替加環(huán)素需要關(guān)閉環(huán)境燈光。稱量的藥物并非純度為100%，需要更具藥物標(biāo)準(zhǔn)品的說明書進(jìn)行換算。2.藥物自身對測定結(jié)果的影響44.若用替加環(huán)素臨床用藥，則將整瓶藥粉溶解。如圖：50mg若加入10ml溶劑則終濃度為5mg/ml2.藥物自身對測定結(jié)果的影響45.根據(jù)CLSI推薦的方法溶解藥物2.藥物自身對測定結(jié)果的影響46.2.藥物自身對測定結(jié)果的影響

溶解后的藥物盡快使用完溶解后的替加環(huán)素為黃色透明液體。立即使用完畢，即使在冰箱內(nèi)冷凍也不能防止藥物的降解。47.2.藥物自身對測定結(jié)果的影響

標(biāo)準(zhǔn)品和臨床用藥（泰閣）之間的差別泰閣/標(biāo)準(zhǔn)品(MIC比值)菌株數(shù)（%）0.51（0.58%）1158（92.39）212（7.01）48.3.培養(yǎng)基對測定結(jié)果的影響B(tài)D培養(yǎng)基：Etest>微量肉湯稀釋法；Etest：BD的MH>oxoid的ISOCohenStuartJ,etal.AAC.2010Jun;54(6):2746-7.49.3.培養(yǎng)基對測定結(jié)果的影響

錳離子對Etest法對替加環(huán)素測定結(jié)果影響的相關(guān)報道在Acinetobacter

spp.、

S.marcescens、

S.pneumoniae

中Etest檢測方法的MIC結(jié)果較微量肉湯稀釋法高，尤其是在鮑曼MIC90高4個稀釋倍數(shù)，認(rèn)為可能與Etest使用的瓊脂中錳離子含量較高有關(guān)。研究顯示，培養(yǎng)基中高濃度的錳離子導(dǎo)致Etest檢測3株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值升高4-12倍，50株臨床分離菌的MIC值升高2-8倍。ChrisM.PillarJClinMicrobiol.

2008September;

46(9):2862–2867.Fernandez-MazarrasaC,etal.JClinMicrobiol2009