尼達(dá)尼布對肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究

尼達(dá)尼布對肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究目的:探討尼達(dá)尼布是否通過影響VEGF/TGF-β1/Notch1信號通路抑制肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT),進(jìn)而抑制肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)的發(fā)生與發(fā)展,從而為PF的治療提供了理論依據(jù)。方法:雄性SD大鼠52只,隨機(jī)分為對照組、博來霉素(Bleomycin,BLM)組、BLM+尼達(dá)尼布(50mg/kg)劑量組、BLM+尼達(dá)尼布(100mg/kg)劑量組,每組12只。采用氣管內(nèi)注射博來霉素(5000U/kg)來建立大鼠的肺纖維化模型。造模后連續(xù)灌胃給藥四周,對照組和模型組在相同環(huán)境下給予相等體積(1mL/100g)生理鹽水。HE和Masson染色分別觀察肺組織病理變化及膠原沉積情況。免疫組織化學(xué)法檢測肺組織轉(zhuǎn)化生成因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、I型膠原(collagenI)蛋白的陽性表達(dá)情況。大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(RLE-6TN)隨機(jī)分為5組:Control組、血管內(nèi)皮生成因子(VEGF,10ng/mL)組、VEGF+尼達(dá)尼布(1、10、100nmol/L)劑量組。細(xì)胞用VEGF預(yù)處理1h,再加入不同劑量的尼達(dá)尼布處理48h。Realtime-PCR檢測肺組織及(或)細(xì)胞collagenI、III型膠原(collagenIII)、α-SMA、波形蛋白(Vimentin)、E-鈣粘蛋白(E-Cadherin)、緊密結(jié)合蛋白(ZO-1)、VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA的表達(dá)情況。Westernblot分析肺組織及(或)細(xì)胞中collagenI、collagenIII、Vimentin、α-SMA、ZO-1、E-Cadherin、VEGF、TGF-β1、Notch1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.動物實(shí)驗(yàn)(1)HE染色結(jié)果顯示正常組的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)無明顯破壞,無明顯炎癥反應(yīng)。與正常組相比,BLM組的大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,炎性細(xì)胞浸潤,肺組織發(fā)生實(shí)質(zhì)性病變,肺泡間隔變寬,成纖維細(xì)胞顯著增生。與模型組相比,尼達(dá)尼布各組給藥四周后上述病理變化明顯減輕。(2)Masson染色結(jié)果顯示正常組的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)無明顯改變,肺間質(zhì)僅有少量膠原表達(dá)。與正常組相比,BLM組肺泡間隔明顯增厚,肺間質(zhì)膠原沉積明顯增多,而不同劑量尼達(dá)尼布連續(xù)給藥28天后肺組織膠原沉積明顯減輕。免疫組化、real-timePCR及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組的大鼠的肺組織中collagenI、IIImRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與BLM組相比,尼達(dá)尼布各劑量組的肺組織collagenI、collagenIIImRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。(3)免疫組化、real-timePCR及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組大鼠肺組織中Vimentin、α-SMAmRNA及蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)而E-cadherin及ZO-1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01);與BLM組相比,尼達(dá)尼布各劑量組的肺組織α-SMA、VimentinmRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)而E-cadherin及ZO-1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01)。(4)免疫組化、real-timePCR及Westernblot分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組大鼠肺組織中VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與BLM組相比,不同劑量尼達(dá)尼布能明顯下調(diào)肺組織VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)Real-timePCR和Westernblot結(jié)果顯示,與Control組相比,VEGF組TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與VEGF組相比,不同劑量尼達(dá)尼布組TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。(2)與Control組相比,VEGF組中Vimentin、α-SMAmRNA和蛋白均出現(xiàn)不同水平的上調(diào)(P<0.01)。而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白均出現(xiàn)了不同水平的下降(P<0.01)。與VEGF組相比,不同劑量尼達(dá)尼布組Vimentin,α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)均不同程度的下調(diào),而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均不同水平的上升(P<0.05或P<0.01)。(3)與正常組相比,VEGF組collagenI、collagenIIImRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與VEGF組相比,不同劑量尼達(dá)尼布組collagenI、collagenIIImRN