DB13-T1767-2013蘋果品種DNA指紋鑒定

ICS65.020.20B05

DB13河 北 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB13/T1767—2013蘋果品種DNA指紋鑒定20132013090520130930河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB13/T1767—2013前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省林業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。IIDB13/T1767—2013DB13/T1767—2013DB13/T1767—2013DB13/T1767—2013蘋果品種DNA指紋鑒定范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蘋果品種DNA指紋鑒定的方法及判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果品種鑒定及河北省蘋果品種DNA指紋庫的建立。原理DNADNANASRSSPCRPR擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（或通過DNA分析儀、測序儀進(jìn)行分離），并通過染色顯示DNA蘋果品種DNA指紋鑒定所需儀器設(shè)備及試劑名單見附錄A。蘋果品種DNA指紋鑒定所需儀器設(shè)備及試劑名單見附錄A。4溶液配制蘋果品種DNA指紋鑒定相關(guān)溶液配制方法見附錄B。5鑒定方法樣品準(zhǔn)備取樣量每份送檢樣品至少檢測3個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體至少1g，對一致性差的樣品應(yīng)至少檢測5個(gè)個(gè)體。送檢樣品提供兩份，一份為待檢品種，一份為對照品種。將待檢品種與對照品種直接進(jìn)行成對比較。雜交后代需提供母本與父本的樣品。DNADNA5.2DNA提取1CTAB200mg1.5mL500μLDNA1mL30μLβ-5min4℃，12000g8min700μLCTAB65℃60min后于室溫冷卻4mn～5mi//異戊醇(5∶24∶12000g8min1.5mL(24∶1)，充5min，12000g8min(24∶1)220℃沉30，12000g10min100μLDNADNA檢測。PCRSSR基本核心引物名單見附錄C。反應(yīng)體系反應(yīng)液體積為20μL，組分配制應(yīng)符合表1的規(guī)定（或按比例減少至10μL）。表1PCR反應(yīng)組分原濃度終濃度反應(yīng)體積μLddH2O13.3510×buffer10×1×2MgCl225l/L2.5l/L2dNTP2.5ml/L0.15ml/L1.2Taq酶5U/μL1U0.2引物20μl/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.~.5n/μL15.3.3反應(yīng)程序5.3.3反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。清洗玻璃板，95%涂上0.5mL0.5組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。2顯影液中輕輕晃動至帶紋出現(xiàn)定影顯影液中輕輕晃動至帶紋出現(xiàn)定影5in雙蒸水漂洗1in灌膠在100mL45%PAGETEMED和25100μL預(yù)電泳在正極槽中加入1×TBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的I×TBE緩沖液600mL，拔出梳子。90W10min~20min。變性在20μLPCR4μL6PCR儀上運(yùn)行變性程序:95℃變性冷卻10min以上。電泳5μL80W40min)銀染銀染銀染10~15in3in110s110s130s6結(jié)果及判定3數(shù)據(jù)表示以多數(shù)個(gè)具有的帶即主作為品的特征帶當(dāng)無法判主帶時(shí)出各種帶所占比率譜帶記錄式:每個(gè)心引物所有譜按擴(kuò)片從大到小順序編，用二代碼描述依次為、02 )，確定代表?xiàng)l譜帶一套標(biāo)準(zhǔn)種每個(gè)待測品種每個(gè)引物點(diǎn)上的帶號用四代碼描述，參照標(biāo)準(zhǔn)品種確定待測品種的譜帶號。示例1：在一個(gè)核心引物上僅有一條譜帶02，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為0202；示例2：在一個(gè)核心引物上有兩條譜帶02和03，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為0203。17DNA17DNA172＝1＝0bc1734DNA2c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。6.3鑒定報(bào)告鑒定報(bào)告書格式見附錄D。4c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。6.3鑒定報(bào)告鑒定報(bào)告書格式見附錄D。4附錄A（規(guī)范性附錄）儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備PCR96孔;3000V,400mA,400W;水平搖床;膠片觀察燈;電子天平;微量加樣器;磁力攪拌器;高速離心機(jī)高速離心機(jī)高壓滅菌鍋;pH酸度計(jì)。A.2試劑所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。Tris堿;鹽酸;氫氧化鈉;10×Buffe:緩沖液;:4dNTP;TaqDNASSR引物;礦物油;5澳酚藍(lán);二甲苯青FF;丙烯酰胺;硼酸;脲素;親和硅烷:97剝離硅烷:2無水乙醇;(TEMED)過硫酸銨;冰醋酸;硝酸銀;A.2.24甲醛溶液:37%。A.2.24甲醛溶液:37%。6附錄B（規(guī)范性附錄）溶液配制DNA0.5mol/LEDTA溶液186.lg800NaOH8.01mol/LTris-HCI60.55gTrisHCI8.0500高壓滅菌。洗滌液100Mris-HC,lH8.0;50MED;1Ml1β-巰基乙醇;%PCTAB100100ol/Lris-HCl（020ol/LED-Na1.4l/aC2%C0.%（V/V）的β-巰基乙醇(注：先將除巰基乙醇之外的藥品配好，高壓蒸汽滅菌之后加入巰基乙醇)酚/氯仿/25：24：1。TE緩沖液1ll/Lris-HC15，0.5ol/LEDA1，加I調(diào)H至8.0500。TE緩沖液2ll/Lris-HC15r，0.5l/LEDA1，0.5ol/LI100，定容至500。5mol/LNaCI溶液146gNaCI500。B.2PCR擴(kuò)增溶液的配制dNTP、G、、T100mmol/L20μL720μL.5ol/Lach2.5ol/Lach的工作液。SSR引物4l/L0μ1/L的工作7液。注:干粉配制前應(yīng)首先快速離心。B.2.3649，0.5l/L的EDA溶液()1，澳酚蘭0.1250.125。40%PAGE膠190g10g500。4.5%PAGE膠450g，10TBE100112.5。Bind緩沖液49.75250μL50。1mLBind5μLBind2%二甲基二氯硅烷。2%二甲基二氯硅烷。B.3.625%0.25g1超純水中。10×TBEris堿108，硼酸55，0.5l/LEDA溶液37L，定容至100。1×TBE10×TBE緩沖液500mL，加水定容至5000mL。B.4銀染溶液的配制固定液1001000。染色液2g1000。顯影液1000mL蒸餾水中加入30g氧氧化鈉和5mL甲醛。8附錄C（）標(biāo)記位點(diǎn)染色推薦5’-’）（5’-’）CH03g121IGCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTGCH02b102ICAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTGCH03g073IAATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTTCH02h11a4ICGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTCCH03a095IGCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGGCH03d126IGCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGGCH02a047IGAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGGCH01c068ITTCCCCATCATCGATCTCTCAAACTGAAGCCATGAGGGCCH01f03b9IGAGAAGCAAATGCAAAACCCCTCCCCGGCTCCTATTCTACCH02a0810IGAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCCCH02d0811ITCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTCCH01F0212IACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGCCH05c0413ICCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGGCH03d0814ICATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGACH02c0915ITTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATGCH05a0416IGAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCCCH01h0117IGAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTTHi02c071IIAGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGGCH02c02a2IICTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTCMS14h033IICGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATACH04e024IIGGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTATCH05f065IITTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAGCH03d076IICAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTACH04e057IIAGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCATCH01f098IIATGTACATCAAAGTGTGGATTGAATTCCAATTTCAGAACAGGCH01h029IIAGAGCTTCGAGCTTCGTTTGATCTTTTGGTGCTCCCACACCH02B03b10IIATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTGCH04g0711IICCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGACH04d0212IICGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACTCH03a0813IITTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACGCH03g0414IIATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTTCH02d1115IIAGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGCCH04f1016IIGTAATGGAAATACAGTTTCACAATTAAATGCTTGGTGTGTTTTGCCH05g0317IIGCTTTGAATGGATACAGGAACCCCTGTCTCATGGCATTGTTG注：I型標(biāo)記含首先采用的17對引物，II型標(biāo)記含候補(bǔ)采用的17對引物。99附錄D（規(guī)范性附錄）蘋果品種DNA指紋鑒定報(bào)告書檢單位： 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