實驗一 血涂片的制備及實驗一 有機實驗入門及蒸餾和沸點的測定

實驗二、血涂片的制備和血細胞的觀察目的要求1.掌握血涂片的的制備方法2.認識紅細胞及各種白細胞的典型形態(tài)基本原理涂片技術是制備血液樣品最常用的技術。將血液樣品制成單層細胞的涂片標本，染色后可對血液中各種細胞形態(tài)進行形態(tài)觀察、細胞計數、細胞大小測量等工作。實驗用品1.器材：醫(yī)用一次性采血針、酒精棉球、鑷子、經脫脂洗凈的載玻片；2.試劑：Wright’s染液：Wright’s色素粉末0.1g，溶于60ml甲醇。方法與步驟1．采血采血前用70％酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血針刺破指腹或耳垂的皮膚；動物采血時先將耳部剪毛，酒精消毒后，刺破動物耳部皮膚，擠去第一滴血不要（因含單核白細胞較多）。2．涂片擠出第二滴血置于載玻片的一端，再取另一張邊緣光滑的載玻片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀，兩玻片的角度以45°為宜（角度過大血膜較厚，角度小則血膜薄），輕輕將載玻片向前推進，即涂成血液薄膜（圖2-2）。推進時速度要一致，否則血膜成波浪形，厚薄不勻，初學者可把玻片放在桌上操作。3．染色待涂片在空氣中完全干燥后，滴加數滴Wright’s染液蓋滿血膜為止，染色1～3min。然后滴加等量的緩沖液（pH6.4）或蒸餾水，使其與染液均勻混合，靜置2～5min。用蒸餾水沖去染液，吸水紙吸干。4．鏡檢顯微鏡觀察可見人紅細胞為凹圓盤形，無核，淡紅色，緣部分染色較深，中心較淺，直徑7-8微米。白細胞數目少，為圓形。顆粒白細胞（1）嗜中性顆粒白細胞：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀，可分1-5葉，直徑10-12微米；（2）嗜酸性顆粒白細胞：略大于嗜中性白細胞，細胞核染成紫色，通常為2葉，胞質充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色，直徑10-15微米；（3）嗜堿性顆粒白細胞：體積略小于嗜酸性白細胞，細胞質中有大小不等被染成紫色的顆粒，顆粒數目較嗜酸性白細胞的顆粒少，核1-2葉，染成淡藍色，直徑10-11微米。無顆粒白細胞（1）淋巴細胞：可觀察到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅細胞大小相似，圓形，核致密，染成深紫色。周圍僅一薄層嗜堿性染成淡藍的細胞質。中淋巴細胞較大，核圓形。直徑6-8微米。（2）單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質染成灰藍色。核呈腎形或馬蹄形，染色略淺于淋巴細胞的核。直徑14-20微米。血小板為不規(guī)則小體，直徑2-3微米。其周圍部分淺藍色，中央有細小的紫紅色顆粒，聚集成群。實驗報告內容繪制人血涂片鏡下圖

血涂片是通過特定的方法將血液按一定方向均勻涂開的過程，微觀上使細胞是由球形變?yōu)槠矫嫘位蚪矫嫘纹戒佋谳d玻片上。血涂片的顯微鏡檢查是血液細胞形態(tài)學檢查的基本步驟，特別是對于各種血液病的診斷和鑒別診斷，具有重要價值。血涂片制備是否合格、染色的好壞直接關系到檢驗結果的質量。（一）血涂片制備1.載玻片的準備新載玻片常帶有游離堿質，須用濃度為lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水徹底沖洗，干燥后備用。舊載玻片要用含洗滌劑的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反復沖洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥備用。使用載玻片時，不要用手觸及玻片表面，保持玻片清潔、干燥、中性、無油膩。2.血涂片制作方法取血液標本一滴置載玻片的一端，以邊緣平滑的推片一端，從血滴前沿方向接觸血液，使血液沿推片散開，推片與載玻片保持30～45度夾角，平穩(wěn)地向前推動，血液即在載玻片上形成薄層血膜(圖1—1)。圖2—1血涂片的制作步驟示意圖涂片的厚薄與血滴大小、推片與載玻片之間的角度、推片時的速度及血細胞比容有關。血滴大、角度大、速度快則血膜越厚；反之則血膜越薄。一張良好的血涂片，要求厚薄適宜，頭體尾明顯，細胞分布均勻，血膜邊緣整齊并留有的空隙。下面是幾種血涂片效果模式圖及形成原因(圖l—2)。圖2—2幾種血涂片效果比較（二）血涂片染色染色的目的是使細胞的主要結構，如細胞膜、細胞質、細胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識別。血涂片染色包括兩個過程：固定和染色。固定是將細胞蛋白質和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持細胞原有形態(tài)結構不發(fā)生變化。常用的染色方法有瑞特染色法(Wright)、姬姆薩染色法(Giemsa)等。1.瑞特（Wright）染色法本法的特點是將固定和染色合并在一起進行，手續(xù)簡便，染色時間短，對白細胞特異性顆粒著色較好，但對核的著色略差。（1）瑞特染料由酸性染料伊紅和堿性染料美藍組成的復合染料。伊紅為鈉鹽，有色部分為陰離子。美藍為氯鹽，有色部分為陽離子。美藍和伊紅的水溶液混合后，產生一種不溶于水的伊紅化美藍(ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成為瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解離為M＋和E－，兩種有色離子可以選擇性地與細胞內不同成分結合。另一方面因其具有強大的脫水作用，可將細胞瞬間固定，蛋白質被沉淀為顆粒狀或者網狀結構，表面積增加，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。（2）緩沖液pH6.4～6.8的磷酸鹽緩沖液，其作用是使染色環(huán)境維持在弱酸性，達到最佳的染色效果。（3）細胞的著色原理細胞的著色既有化學的親合作用，又有物理的吸附作用。不同的細胞由于其所含化學成分不一樣，化學性質各不相同，所以對染料的親合力也不一樣。①細胞中的堿性物質與酸性染料伊紅結合染成紅色，因此，該物質又稱為嗜酸性物質。如紅細胞中的血紅蛋白及嗜酸粒細胞中的嗜酸性顆粒等與伊紅結合。②細胞中的酸性物質可與堿性染料美藍結合而染成藍紫色，該物質又稱嗜堿性物質。如淋巴細胞胞質及嗜堿粒細胞的顆粒為酸性物質，與堿性染料美藍結合。③中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅美藍均可結合，染淡紫紅色為中性物質。另外細胞核蛋白主要由脫氧核糖核酸和強堿性的組蛋白等組成，與酸性伊紅結合染成紅色，但因核蛋白中還含有少量的弱酸性物質，與堿性美藍作用染成藍色，因含量太少，藍色反應極弱，故也被染成紫紅色。④原始紅細胞和早幼紅細胞的胞質含有較多的酸性物質，與美藍親合力強，故染成較濃厚的藍色；隨著細胞的發(fā)育，晚幼紅細胞階段既含有酸性物質，又含有堿性物質（Hb），既能與堿性染料美藍結合，又能與酸性染料伊紅結合，故染成紅藍色或灰紅色；當紅細胞完全成熟，酸性物質徹底消失后，只與伊紅結合，則染成粉紅色。圖2－3瑞特染色原理示意圖（4）pH對細胞染色的影響細胞著色對氫離子濃度十分敏感。細胞各種成分均由蛋白質構成，由于蛋白質是兩性電解質，所帶電荷的正負數量隨溶液pH值而定。對某一蛋白質而言，如果環(huán)境的pH小于其等電點（PI），則該蛋白質帶正電荷即在酸性環(huán)境中正電荷增多，易與酸性伊紅結合，染色偏紅；相反，當環(huán)境的pH大于PI即在堿性環(huán)境中負電荷增多，則易與美藍結合染色偏藍。因此，要使用清潔中性的載玻片、優(yōu)質的甲醇做溶劑和用緩沖液(pH6．4～6．8)來調節(jié)染色時的pH值，達到滿意的染色效果。（5）染色效果分析正常情況：血膜外觀呈淡粉紅色或琥珀色。顯微鏡下，成熟紅細胞呈粉紅色。白細胞胞質中顆粒清楚，并顯示出各種細胞特有的色彩，細胞核染紫紅色，核染色質結構清楚。染色偏酸：紅細胞和嗜酸粒細胞顆粒偏紅，白細胞核呈淡藍色或不著色。染色偏堿：所有細胞呈灰藍色，顆粒深暗；嗜酸粒細胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或藍色；中性顆粒偏粗，染成紫黑色。（三）血涂片染色的質量控制1．載玻片必須非常潔凈，中性，無油脂。不清潔或非中性的載玻片會造成細胞特別是紅細胞形態(tài)發(fā)生改變，導致假性的異常形態(tài)紅細胞出現(xiàn)。非中性的載玻片還會影響染色環(huán)境的pH值，帶油脂的載玻片會使細胞分布不均勻。2．良好血涂片的“標準”。血膜由厚到薄逐漸過度，血膜的體尾交界部位紅細胞分布均勻，既不重疊又互相緊靠相連。3.EDTA抗凝血液制備血涂片。由于EDTA能阻止血小板聚集，如需在顯微鏡下觀察血小板形態(tài)時可采用，但EDTA抗凝血有時能引起紅細胞皺縮和白細胞聚集，所以應根據情況恰當選擇。4.白細胞較低和需濃縮白細胞的標本處理。為獲得較多白細胞，可將抗凝血適當離心，使密度相同細胞集中并分層，然后取紅細胞層上薄的灰白色層（有核細胞和血小板較集中)涂片、染色。該方法非常適合于白細胞減低患者的白細胞分類計數及紅斑狼瘡細胞檢查。5.血細胞比容與涂片關系。血細胞比容高于正常時，紅細胞較多，血液粘度較高，用較小的角度涂片，可獲得滿意的血膜。相反，血細胞比容低于正常時，血液粘度較低，需用較大角度涂片。6.新配制的瑞氏染液處置。新配制的瑞氏染液包括瑞－姬染液，pH偏堿，染色效果不太理想，需在室溫放置一段時間，其中美藍逐漸轉變?yōu)樘烨郆。在密封條件下，貯存時間愈久，轉化的天青B愈多，染色效果愈好。7.染色過深、過淺的處理。染色過深、過淺與血涂片中細胞數量、血膜厚度、染色時間、染液濃度、pH值密切相關。對于重要的標本可采用先試染的方法，根據試染效果調節(jié)第二次染色方式。糾正染色過深可縮短染色時間或稀釋染液。糾正染色過淺可延長染色時間。如果標本片有限出現(xiàn)了染色過深、過淺的情況，可用如下辦法挽救：染色過深可加少量緩沖液覆蓋血膜部分褪色，在顯微鏡下觀察褪色情況及時終止。染色過淺可重加染色液和緩沖液復染，也要在顯微鏡下觀察及時終止。瑞氏染液英文拼寫Wright'sstain是由酸性染料伊紅和堿性染料美藍組成的復合染料，溶于甲醇。后解離為帶正電的美藍和帶負電的伊紅離子。使用方法瑞氏（Wright'sstaim；美藍－伊紅Ｙ）染色：1．瑞氏染料是由堿性染料美藍（Methvlemblue）和酸性染料黃色伊紅（EostmY）合稱伊紅美藍染料即瑞氏（美藍－伊紅Ｙ）染料。2．用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：（1）甲醇使瑞氏染料中美藍（M）與伊紅（E）在溶液中離解，可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而著色。甲醇ME（瑞氏染料）----→M++E-在配制的瑞氏染液中美藍如放置過久即可氧化而含有天青，美藍天青與伊紅化合物能使核染成紫紅色，但不能使胞漿染為藍色，多余美藍就可以使胞漿染成藍色，染色主要是化學作用，是離子彼此結合的反應。（2）甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態(tài)及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。染液配制(1)瑞氏染液配制：瑞氏染料830gm或1g甲醇（AR）500ml或600ml○先稱干燥（事先放入溫箱干燥過夜）瑞氏染料放置乳缽內，用乳棒輕輕敲碎染料成粉末，再行研磨至聽不到研芝麻聲即呈細粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤，而無染料粉粒沉著?！鹪偌虞^多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一清潔儲存瓶內（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重復數次，至乳缽內染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口?！鸫媸覝匕堤?，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲存3個月以上為佳。(2)緩沖液：●緩沖液作用：○染色對氫離子濃度是十分敏感的，據觀察pH值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。○緩沖液須保持一定的pH使染色穩(wěn)定，PBS的pH一般在6.4~6.8，○偏堿性染料可與緩沖液中酸基起中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使pH恒定。緩沖液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：配方1：配方2：1%KH2PO430mlM/15KH2PO473.5ml1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5mlH2O(新鮮)加至1000ml置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染則應報廢。染液鑒定瑞氏或姬姆薩染色液鑒定：剛配好或放置一個月以上的染液可進行下列鑒定：1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速擴散開，其顏色變紫紅色，且有偽足形成。2．取1滴染液加1滴緩沖液，染液由深藍色立即變?yōu)樽霞t色。3．取血片或骨髓片進行試染檢查，觀察染色后各類細胞的胞核、胞漿及顆粒著色情況，pH是否合適及染色合適時間。如有上述變化，表明染液合格，可供使用。人體內白細胞總數和種類白細胞的百分比是相對穩(wěn)定的。正常人每立方毫米的血液時白細胞為止5000～10000個。各種白細胞的百分比為：中性粒細胞50～70%；嗜酸性粒細胞1～4%；嗜好堿性粒細胞0～1%；淋巴細胞20～40%；單核細胞為1～7%。機體發(fā)生炎癥或其他疾病都可引起白細胞總數及各種白細胞的百分比發(fā)生變化，因此檢查白細胞總數及白細胞分類計數成為輔助診斷的一種重要方法。實驗一有機實驗入門及蒸餾和沸點的測定一.實驗目的:1.熟悉有機化學實驗室的注意事項和安全知識以及有機化學實驗的基本要求；2.掌握實驗報告及實驗記錄的規(guī)范書寫；3.了解測定沸點的意義。 4.掌握常量法(蒸餾法)測定沸點的原理和方法。第一部分實驗入門一.有機化學實驗室的注意事項（強調紀律）1、不能遲到、隨便請假。請病假要有醫(yī)院、班主任批條。2、進入實驗室要穿實驗服，不得穿拖鞋，不得將食品和飲料帶入實驗室；3、實驗時要求思想集中、認真仔細，按照操作規(guī)程和老師所講要求進行實驗。合理安排好自己的時間，在規(guī)定課時內結束實驗。4、實驗時要保持室內安靜，相互交流要小聲，不得隨意喧鬧、走動，不能擅自離開實驗室。5、實驗時不能亂丟雜物、廢紙。保持實驗室的整潔。每次由班長安排幾名學生做值日，負責桌面、地面、水槽的清潔工作，并負責檢查水、電、門窗是否關好。6、愛護公物，配備的儀器要自己管好（兩人一套），儀器損壞要報告老師，做登記后補上（按價賠償）。7、公用儀器、藥品用完后要立即歸還原處。不得隨意亂丟，損壞按價賠償。8、在實驗前不要洗儀器。實驗完后務必洗凈儀器并倒置，保證下周做實驗時儀器干凈、干燥。清洗好儀器后交給老師清點、簽名。二、實驗室的安全事故的預防與處理（強調安全）有機化學實驗的安全操作、以及事故的預防與處理尤為重要，一定要在預先有相當的重視與認識。下列事項應予以切實執(zhí)行。1、實驗開始前，應先將實驗室通風扇打開。2、實驗操作時，應檢查儀器是否完整無損、實驗裝置（如回流、蒸餾裝置）是否裝置正確、穩(wěn)妥、各儀器接口間有否漏氣。需要水冷凝的裝置，點火前應將冷凝水接通，否則有機溶劑泄露或大量蒸汽不及冷凝而逸出，易造成火災。在作常壓操作時，整套裝置要保證與大氣相通，否則裝置密閉易致爆炸。3、在做蒸餾或回流實驗時，應在燒瓶中放入沸石，以免液體因過熱而暴沸沖出。若預先忘了放，應馬上停止加熱，稍冷后再補加。切不要熱的時候加沸石，而使液體暴沸沖出，造成危險。4、在移取或添加易燃溶劑時。如乙醚、乙醇、和苯等。務必使他們遠離或熄滅火源。在加熱這些溶劑時不要直接用明火加熱。可以用水浴、空氣浴、石棉網等。5、切勿用敞口的容器存放、加熱或蒸除有機溶劑，否則揮發(fā)后的溶劑濃度一大，易著火。也易因溶劑有毒而中毒。所以有機儀器用的更多的是帶磨口，可蓋上蓋的燒瓶與錐形瓶，而不是敞口的試管、燒杯。6、著火處理：，千萬不要驚慌，先馬上關閉電器的閥門，再用濕抹布、石棉布或者黃砂來撲滅。若火勢較大，應根據具體情況采用不同的滅火器進行滅火。（二氧化碳滅火器：最常用，用以撲滅有機物和電器；四氯化碳：應用在通風良好的大空間內的電器及電器內著火；泡沫滅火器：用以大火撲滅。一般不用）。若油浴和有機溶劑著火，絕對不能用水澆，因為這樣反而會使火焰蔓延開來。7、實驗室所用的藥品試劑一般都放在公用桌面上。藥品就在公用臺面上稱取，不得隨意散失。對易燃溶劑要注意附近有否明火。在移取腐蝕性試劑如濃硫酸時，小心手與衣服。移取好的液體，也要擺放好，小心倒翻。8、由于有機試劑許多是有毒的，所以在實驗中，嚴禁吸煙、喝水、吃食品，實驗后要洗手。9、若不小心被試劑灼傷。對于酸，先用大量水沖洗，再以3-5%碳酸氫鈉液洗，最后再用水洗。對于堿，先用大量水沖洗，再以1-2%硼酸液洗，最后再用水洗。嚴重時涂上甘油或燙傷藥膏。10、玻璃儀器要輕放，小心打碎劃破手。移取燙手的儀器時要用抹布，以免燙傷手。11、在實驗時必須穿實驗服，以免不小心讓有腐蝕性的試劑沾上而損壞。三、實驗預習、記錄和實驗報告規(guī)范要求（著重講）1.實驗預習（按照實驗預習要求進行，并備一專用本，以備教師抽查）預習筆記主要包括以下內容：（1）目的、要求 （2）反應原理。可用反應式寫出主反應及主要副反應，并簡述反應機理。（3）查閱并列出主要試劑和產物的物化常數及性質，試劑的規(guī)格、用量。（4）畫出主要反應裝置圖，簡述實驗步驟及操作原理。（5）做合成實驗時，應寫出粗產物純化的流程圖。（6）實驗中可能出現(xiàn)的問題，特別是安全問題，要寫出防范措施和解決辦法。2、實驗操作與記錄實驗過程中要精力集中，仔細觀察實驗現(xiàn)象，實事求實地記錄實驗步驟、現(xiàn)象和數據，①加入原料的量、順序、顏色。②隨溫度的升高，反應液顏色的變化、有無沉淀及氣體出現(xiàn)。③產品的量和顏色等數據，要及時并真實的記錄。記錄時，要與操作一一對應，內容要簡明準確，書寫清楚。實驗記錄參考有機實驗書P19頁實驗記錄應做到及時、準確、簡明，不應追記、漏記和憑想象記（每次實驗結束后實驗記錄紙連同實驗產品交老師審查簽字）。3、實驗報告書寫規(guī)范參考有機實驗書P17頁：組成：一、實驗目的，二、實驗原理，三、實驗藥品和儀器，四、實驗裝置圖，五、實驗步驟，六、實驗記錄（粘貼），七、實驗結果，八、思考題實驗報告必須按規(guī)范書寫，并且每個實驗報告必須至少2頁，否則重寫。四、有機化學實驗常用儀器和設備（請拿儀器給學生依次介紹）請強調每個實驗前后都要檢查自己筐中的玻璃儀器，不得損壞和亂放。第二部分蒸餾及沸點的測定一.實驗原理:當液體物質被加熱時，該物質的蒸氣壓達到與外界施于液面的總壓力（通常是大氣壓力）時液體沸騰，這時的溫度稱為沸點。常壓蒸餾就是將液體加熱到沸騰變成蒸氣，又將蒸氣冷凝得到液體的過程。每種純液態(tài)的有機物在一定的壓力下均有固定的沸點。利用蒸餾可將二種或兩種以上沸點相差較大（>30℃）的液體混合物分開。純液體化合物的沸距一般為0.5～1℃，混合物的沸距則較長?？梢岳谜麴s來測定液體化合物的沸點。二、實驗儀器和藥品請學生自已整理羅列三、實驗裝置圖四.實驗步驟蒸餾實驗裝置主要包括蒸餾燒瓶，冷凝管，接受器三部分。儀器按從下往上，從左到右原則安置完畢，注意各磨口之間的連接。根據被蒸液