高效菌篩選方法及策略

關于高效菌篩選方法及策略第三章高效有機物降解菌的構建

技術及策略

第一節(jié)高效有機物降解菌的構建技術一、傳統分離及馴化技術二、誘變技術三、細胞融合技術四、基因重組技術五、基因工程第2頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

第三章高效有機物降解菌的構建技

術和策略

第二節(jié)高效有機物降解菌的構建策略一、優(yōu)化污染物的降解途徑1.重組互補代謝途徑2.改變污染物代謝產物流向3.同源基因體外隨機拼接4.拓寬氧化酶的專一性二、提高污染物生物可利用性1.重組表面活性劑編碼基因2.重組污染物跨膜轉運基因三、增強細菌的環(huán)境適應性1.增強細菌的抗毒能力2.增強細菌的放射線耐受性第3頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)高效有機物降解菌的構建技術一、傳統分離及馴化技術不經人工誘變，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育或自然分離。微生物自然突變有兩種原因：(1)自然環(huán)境中存在的低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低濃度的誘變物質和微生物自身代謝產生誘變物質的作用引起的突變；（2）在DNA的復制過程中所發(fā)生的錯配。

第4頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一、傳統分離及馴化技術來源：土壤、水、空氣、動植物極其腐敗殘體、有機物污染地區(qū)、污水處理系統中。采樣增殖培養(yǎng)純種分離篩選性能鑒定第5頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一、傳統分離及馴化技術采樣：應根據篩選的目的、微生物分布情況、菌種的主要特征極其生態(tài)關系等因素，確定具體時間、地點和目標物。增殖：為提高分離效率，常以投其所好的原則在培養(yǎng)基中添加特殊的養(yǎng)分，使其所需菌種的數量相對增加。主要是利用不同微生物的生長繁殖對環(huán)境和培養(yǎng)基的特殊要求進行富集培養(yǎng)和要求，控制這些條件使之有利于某類和某種微生物，而對其它微生物不利，再對培養(yǎng)時間加以控制，可以達到初步的分離和富集目的。

第7頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一、傳統分離及馴化技術純化：1.菌落純2.菌株純1.菌落純：從“種”的水平來說是純的，其方法有劃線分離法、涂布分離法和稀釋分離法。2.菌株純：較為精細的單孢子或單細胞分離法。性能鑒定：菌的生長情況、酶活測定、效果測定自然選育是一種簡便易行的選育方法。但自然選育的效率低（10-8—10-10）。第8頁,共78頁，2024年2月25日，星期天二、誘變育種誘變育種是人為地利用物理、化學等因素，使誘變的細胞內遺傳物質染色體或DNA的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復等畸變，或DNA的某一部位發(fā)生改變(又稱點突變)，從而使微生物的遺傳物質DNA或其化學結構發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異。因此，誘發(fā)突變的頻率遠大于自然突變。第9頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共78頁，2024年2月25日，星期天誘變過程出發(fā)菌株的選擇：1.選擇純種作為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質體的影響；2.不僅效果好，而且要考慮其它形狀，如生長快、營養(yǎng)要求低等；3.對誘變劑敏感的菌株；4.選擇已經誘變過的菌株。誘變劑的選擇（物理：紫外線、X射線等，化學：堿基類似物，5-氟尿嘧啶；烷化劑，亞硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考慮誘變劑本身的特點，如紫外線作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基，兩者復合使用，突變譜寬，效果較好。第11頁,共78頁，2024年2月25日，星期天誘變過程影響誘變效果的因素：菌種的生理狀態(tài)：對分裂中的細胞更有效；細胞懸浮液要求生理狀態(tài)一致，為分散均勻的單細胞或單孢子懸浮液（一方面分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面可避免長出不純菌落）。第12頁,共78頁，2024年2月25日，星期天誘變過程

誘變劑的劑量：誘變率隨誘變劑量的增加而提高，但達到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降，使負變異株多，因此，主張用中等劑量，如75%-80%或更低劑量。充分利用復合處理的協同效應。復合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可以用同一誘變劑重復使用。復合處理可擴大突變的位點范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大。第13頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

篩選過程特點：發(fā)生頻率低；隨機性大過程：先初篩，后復篩，測突變菌株性能誘變育種的基本篩選程序：出發(fā)菌株→絕大多數個體死亡，少數存活（存活率）→少數突變（突變率）→少數正變（正變率）→少數降解酶活增加幅度大（增加率）且要求穩(wěn)定

第14頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合

原生質體融合(Protoplastfusion)指在一定選擇條件下，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子。始于1976年，最早是在動物實驗中發(fā)現的，后來早微生物中得以應用。使細胞間基因重組的頻率大大提高了，已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）。發(fā)生基因重組親本的選擇范圍更大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠緣的微生物之間進行。第15頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合在有些情況下，兩種或多種微生物在共同存在時才能降解某種污染物，單獨存在時不能降解該污染物，這可能是因為彼此為對方提供了生長所必須的條件或為對方消除了生長的障礙，使得它們在共存的條件下能夠順利降解環(huán)境污染物。在這種情況下，可以采用原生質體融合技術融合這兩種微生物，融合子就會具備兩個親本的基因與優(yōu)點，能夠降解某種環(huán)境污染物，這也是目前污染治理工程菌制備的一個主要途徑。第16頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合原生質體融合特點：1雜交頻率較高2遺傳物質體傳遞更為完整3存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能4提高效果的潛力較大第17頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合3.1選擇親株：必須選遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株，而且必須帶有可以識別的遺傳標記（多為營養(yǎng)缺陷型或抗藥性標記）。3.2原生質體制備：去除細胞壁是制備原生質體的關鍵，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果較好。影響因素：菌體前處理、菌齡、酶濃度、酶處理溫度、PH、滲透壓穩(wěn)定劑（不僅起保護原生質體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結合。原生質體對滲透壓極其敏感，低滲引起細胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有機物和氯化鉀和氯化鈉等無機物。穩(wěn)定劑的濃度一般均在0.3-0.8mol/L之間。第18頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合3.3原生質體融合：融合促進劑：聚乙二醇（PEG，濃度為25%－40%）可有效促進原生質體融合。另外，紫外線照射和脈沖電場等物理因素處理也能促進原生質體融合。3.4原生質體再生：是使原生質體重新長出細胞壁，恢復完整的細胞形態(tài)結構?？稍偕闹徽荚|體的一部分，細菌再生率為3%~10%；真菌為20%~80%。用再生培養(yǎng)基。提高再生率必須避免因強力動作而使原生質體破裂，另外菌液濃度不宜太高。菌齡、再生時的溫度、溶菌酶用量和溶壁時間、細胞壁去除程度等因素都會影響再生。第19頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三.原生質體融合3.5篩選優(yōu)良性狀融合重組子：原生質體融合后，來自兩親代的遺傳物質經過交換并發(fā)生重組而形成的子代成為融合重組子。這種重組子通過兩親株遺傳標記的互補而得以識別。（真正的融合和暫時的融合）融合子生理生化測定。原生質體技術還可用于誘變育種中。第20頁,共78頁，2024年2月25日，星期天四、基因重組技術

1.轉化受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，再經復制就使自己變成一個轉化子。在原核生物中，轉化是一個較普遍的現象。能進行轉化的受體細胞必須處于感受態(tài)（受體細胞最易接受外源DNA片段并實現其轉化的一種生理狀態(tài)）。感受態(tài)因子是一種胞外蛋白?？赡苁羌毎ど系囊环N組成，催化DNA吸收據推測可能是一種自溶酶第21頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.轉化轉化因子本質：DNA大?。赫技毦巳旧w組的0.3%，含15個基因。轉化頻率：0.1%~1%，最高達10%。呈質粒形式的轉化因子，其轉化頻率最高，因為它進入受體菌后，可不必同受體染色體進行交換、整合即可進行復制和表達，一般認為轉化因子都是線狀雙鏈DNA。

第22頁,共78頁，2024年2月25日，星期天過程：1）雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體細胞表面的特異位點結合；2）在吸附位點上的DNA被核酸內切酶分解，形成片段；3）一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進入細胞；4）DNA片段與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，交換、整合和取代，形成雜合DNA片段；5）受體菌染色體復制，一個為轉化子，一個不是。1.轉化第23頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2.轉導通過轉導噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA小片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現象。第24頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2.傳導通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實現其遺傳性狀傳遞至受體菌的傳導現象。完全缺陷噬菌體：當噬菌體在供體菌內增殖時，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數噬菌體的衣殼與噬菌體頭部DNA芯子相仿的一小段供體菌DNA片段誤包入其中，形成了一個不含噬菌體自身DNA的假噬菌體。進行完全普遍傳導和流產普遍傳導第25頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2.傳導完全普遍傳導：完全缺陷噬菌體將外源DNA導入受體細胞，該片段可與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，再經過雙交換而整合到受體菌染色體組上，使后者成為一個遺傳性狀穩(wěn)定的轉導子。流產普遍傳導：經轉導而獲得的供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內不進行交換、整合和復制，也不迅速消失，而僅進行轉錄、翻譯和性狀表達。第26頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3、接合供體菌（雄）通過其性菌毛與受體菌（雌）相接觸，前者傳遞不同長度的單鏈DNA給后者，并在后者細胞中進行雙鏈化或進一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現象。F因子：決定性別的質粒第28頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程技術基因工程是分子水平上在生物體外用人工方法進行ＤＮＡ的重組，以改變生物的性狀創(chuàng)造生物的新品種或新物種的一門新學科。

對于環(huán)境中難以降解的有毒有害化合物，可通過基因工程的方法，設計新的代謝途徑，利用相關的基因構建工程菌。這樣不僅提高細胞單一酶的濃度增加代謝途徑中某一限制酶的表達，還能使代謝途徑中所有基因的表達獲得同步增加，從而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子進一步降解為無害的末端產物。

第31頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程主要過程：獲得特定的目標基因目標基因片段

DNA重組載體DNA進入受體細胞并擴增、表達具目標基因表達功能重組體第32頁,共78頁，2024年2月25日，星期天黏性末端黏性末端1、限制性核酸內切酶限制酶是在生物體(主要是微生物)內的一種酶，一種限制性內切酶只能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開（切割DNA分子）來源：主要從原核細胞分離作用：

作用結果：EcoRI基因工程的“專用工具”平未端及粘性未端第33頁,共78頁，2024年2月25日，星期天什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第34頁,共78頁，2024年2月25日，星期天要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？要切兩個切口，產生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。第35頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共78頁，2024年2月25日，星期天基因的針線：DNA連接酶G

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G同種限制酶切割第37頁,共78頁，2024年2月25日，星期天基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來(形成磷酸二酯鍵)，這樣一個重組的DNA分子就形成了。第38頁,共78頁，2024年2月25日，星期天導入過程需要運輸工具——運載體。運載體的作用有哪些？作用一：作為運載工具，將外源基因轉移到受體細胞中去。作用二：利用運載體在受體細胞內，對外源基因進行大量復制。第39頁,共78頁，2024年2月25日，星期天（一）載體基因克隆載體條件：（1）具有能使外源DNA片段組入的克隆位點。（2）能攜帶外源DNA進入受體細胞或游離在細胞質中進行自我復制，或整合到染色體DNA上隨DNA復制而復制。（3）必須具有遺傳標記，承載外源DNA的載體進入受體細胞后，以便篩選克隆子。第40頁,共78頁，2024年2月25日，星期天常用的運載體主要有兩類：

1）質粒

2）噬菌體或某些動植物病毒第41頁,共78頁，2024年2月25日，星期天質粒1.質粒的定義：一般來說符合以下3條標準的染色體外的DNA或RNA分子都可以稱之為質粒：(1)質粒是染色體外能自主復制的遺傳因子；(2)不具備胞外期的感染性；(3)它對宿主來說不是必需的。構建質粒載體一般選用分子小和松弛型復制的質粒。松弛型質粒在宿主細胞內可含10－200個拷貝，而且不受宿主細胞蛋白質合成的影響，當宿主細胞蛋白質合成停止時，質粒DNA的復制仍可以繼續(xù)進行，甚至可以將拷貝數增加至數千個。細菌對環(huán)境中的特異性限制因子的應答能力一般是由質?？刂频?，因此，質粒在為宿主細胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態(tài)位的適應中起著非常重要的作用。

第42頁,共78頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的質粒：

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒，其中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標記基因。質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但復制只能在宿主細胞內完成。第43頁,共78頁，2024年2月25日，星期天質粒的生物學特性質粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合環(huán)（SC構型）開環(huán)雙螺旋（OC構型）線狀雙螺旋（L構型）第44頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程

質粒的大小一般為染色體的0.05%~20%或更多，長度為1~20kb，有時細菌中含有大小不同的質粒。質?？梢砸圆煌姆绞皆诩毦姆N群中傳遞，轉移的頻率大到10－2,而染色體的轉移頻率卻只有10－6~10－8。假單胞菌中，發(fā)現有分解功能的質粒，帶有這些質粒的菌表現為具有降解非正常碳源，如樟腦、辛烷、水楊酸等的能力。質粒的消除試驗則是鑒定質粒功能的又一重要手段，通過消除質粒來觀察寄主細胞是否喪失某些性狀。

第45頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程2.質粒的基本性質1）細菌質粒是雙股的共價閉合環(huán)狀DNA分子，即cccDNA。2）每一種質粒有自己特定的核苷酸序列，所以每一種限制酶對每一種質粒都有固定的切點數和切點位置。3）質粒都有自主復制功能。4）不僅能自主復制，而且能平均分配到兩個子細胞中，從而使質粒能穩(wěn)定遺傳。5）具有不相容性。6）都具有一定寄主范圍。第46頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程2.質粒的基本性質7）對寄主細胞是非必須的。8）質粒DNA能通過轉化作用引入到細菌細胞。9）某些質粒為一些特殊的表型編碼，可稱抗性質粒、代謝質粒和毒素質粒等。10）分子量大的質粒一般具有接合功能，即借助于細胞間接觸，供體菌的質?？梢赞D移至受體菌中。11）有些質粒可以以游離于寄主染色體和與染色體整合兩種狀態(tài)存在。12）質粒可用作基因載體。第47頁,共78頁，2024年2月25日，星期天質粒pBR322pBR3224363結構：（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）3種限制酶單一識別位點。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內部有7種，啟動區(qū)內有2種限制酶單一識別位點。（3）DNA復制起點（ori）第48頁,共78頁，2024年2月25日，星期天pBR322質粒的優(yōu)點：（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。（3）具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后,每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。（4）對多種常見的限制性內切核酸酶只含有一個能切割的位點。

pBR3224363第49頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程3.質粒的生態(tài)遺傳學意義質粒有著重要的生態(tài)遺傳學意義，它們作為“微染色體”能從一個細胞中方便地分離出來，并方便地轉入到另一個細胞中去，這一特征為現代生物學的發(fā)展提供了重要的工具和手段。在DNA克隆方法學的發(fā)展進程中，質粒起著至關重要的作用，以質粒作為運載體在細菌中擴增和表達許多外源基因的方法和技術，在工、農、醫(yī)各個領域中都得到了廣泛的應用，并極大地拓展了人們對質粒微生物學認識的視野。第50頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五.基因工程4、載體和目的基因重組4.1以質粒為載體的ＤＮＡ重組質粒是最常用的載體。優(yōu)點：分子量小，可自主或半自主復制，有多個選擇性標記，多個酶切位點，拷貝數多，性能穩(wěn)定?？陕〉淖畲驞NA片段一般在10kb左右。4.2以噬菌體為載體的ＤＮＡ重組先把降解性基因克隆進λ噬菌體內，將重組ＤＮＡ經體外包裝成成熟噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導入寄主細胞。其優(yōu)點在于克隆效率較高，降解性基因整合進寄主染色體后比較穩(wěn)定。缺點是包裝限制問題，對于ＤＮＡ片段大于23ｋｂ降解性基因則不能成功地被克隆。

第51頁,共78頁，2024年2月25日，星期天四個基本步驟：（三）基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運載體結合3）將目的基因導入受體細胞4）目的基因的檢測和表達第52頁,共78頁，2024年2月25日，星期天目的基因是人們所需要轉移或改造的基因。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、降解有機物的降解基因等。目的基因：包括轉錄的啟動區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因。步驟一：目的基因的提取第53頁,共78頁，2024年2月25日，星期天目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉錄法根據已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法

在獲取真核細胞中的目的基因時,一般用人工合成基因的方法.第54頁,共78頁，2024年2月25日，星期天哪些新技術能大大簡化基因工程的操作技術？1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增。第55頁,共78頁，2024年2月25日，星期天步驟二：目的基因與運載體重組

1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第56頁,共78頁，2024年2月25日，星期天基因操作的基本步驟目的基因導入受體細胞的方法1、將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。3、目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。第57頁,共78頁，2024年2月25日，星期天常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：目的基因導入受體細胞第58頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第三步：將目的基因導入受體細胞導入擴增第59頁,共78頁，2024年2月25日，星期天導入過程：運載體為質粒，受體細胞為細菌受體細胞：細菌細胞壁的通透性增大重組質粒進入受體細胞目的基因隨受體細胞的繁殖而復制氯化鈣大量的目的基因第60頁,共78頁，2024年2月25日，星期天步驟四克隆子的篩選和鑒定目的基因導入受體細胞后，真正獲得目的基因并能有效表達的克隆子只是一小部分。1利用克隆載體攜帶的選擇標記基因篩選克隆子。A利用抗菌素抗性基因進行篩選Ampr（抗氨芐青霉素）Cmpr（抗氯霉素）kanr（抗卡那霉素）Tetr（抗四環(huán)素）Strr（抗鏈霉素）。當含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細胞，并在含相應抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，只有獲得載體的受體細胞才能繼續(xù)生長，這樣便可篩選出含克隆載體的克隆子。第61頁,共78頁，2024年2月25日，星期天外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶重組子(ampstetr)空載體(amprtetr)

野生型的E.coli(ampstets)

導入涂布在含Tc的平板上重組子轉化子(ampstetr)空載體轉化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空載體轉化子(amprtetr)因插入外源DNA而導致基因失活的現象稱之為插入失活效應對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是重組質粒轉化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質粒。第62頁,共78頁，2024年2月25日，星期天克隆子篩選與鑒定B利用乳糖操縱子lacZ’

基因篩選克隆子具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯β-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙?；D移酶（A），當培養(yǎng)基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）時，可產生藍色沉淀物，使菌落成藍色。當目的基因插入后lacZ’

基因不能表達，因此，帶有目的基因的重組子菌落呈白色，而沒有轉入目的基因的菌落呈蘭色。第63頁,共78頁，2024年2月25日，星期天克隆子篩選與鑒定2克隆子的進一步鑒定用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假克隆子，為進一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內切酶分析、分子雜交、PCR擴增和DNA測序、目的基因轉錄及翻譯產物檢測等方法。第64頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)基因工程菌構建策略

自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重組，并能在細菌中復制以來，基因工程作為一個新興的研究領域得到了迅速發(fā)展，取得了喜人的成績。因各種環(huán)境條件和生物因子的限制，細菌的進化是相當緩慢的而且沒有一定的方向，因此通過基因工程促進細菌的遺傳進化以滿足生物修復工程的需要。第65頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（1）重組互補代謝途徑：

系列酶（不同菌共代謝）有機污染物小分子化合物缺點：降解速率慢，因為污染物代謝產物在不同降解菌間的跨膜轉運是耗能過程，對細菌來說這是一種不經濟的營養(yǎng)方式。另外，某些污染物的中間代謝產物可能具有毒性或對代謝活性有抑制作用，如不能被迅速代謝利用，積累后將對整個代謝過程產生抑制作用。因此對這些細菌的降解基因進行重組，將分屬于不同細菌個體中的污染物代謝途徑組合起來來構建具有特殊降解功能的超級降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，從而提高生物修復效率。

第66頁,共78頁，2024年2月25日，星期天抑制劑

脫氯

ohb

脫鹵素基因聯苯雙加氧酶（bphA）氯代苯甲酸(CBA)多氯聯苯（PCBs）O2

異戊二烯酸重組體Bph:ohbCO2+H2O

進一步降解第67頁,共78頁，2024年2月25日，星期天硝基芳香化合物，如炸藥，即2，4，6-三硝基甲苯（簡稱TNT）

引入甲苯完整降解質粒pWWO-Km

假單胞菌甲苯TNT氨基甲苯硝基甲苯

構建微生物可以利用TNT為唯一碳源和氮源生長

第68頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（2）改變污染物代謝產物流向污染物降解過程中由于抑制性中間代謝產物的生成或中間產物進入截止式代謝產物途徑而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不徹底。因此可以考慮將細菌對污染物的中間代謝產物流向進行某些改進，使抑制性中間產物不產生或盡量轉化，從而提高污染物降解速率。

第69頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第70頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.優(yōu)化污染物的降解途徑（3）拓寬酶的專一性許多有毒有害有機物，如芳香烴、多氯聯苯、氯化烴等，其代謝反應由多組分氧化酶催化進行。這些關鍵酶的底物專一性阻礙了有機物代謝，如多氯聯苯異構體等，如何拓寬這些酶的底物范圍，是研究的方向。多氯聯苯—聯苯降解菌：不能氧化甲苯甲苯—苯降解菌：不能利用聯苯為碳源生長兩者雙氧合酶編碼基因的遺傳結構、大小和同源性相似，將兩種酶不同組分的編碼基因“混合”