第五章 酶工程制藥技術(shù)

第五章酶工程制藥技術(shù)第一節(jié)概論

第二節(jié)工程制藥酶

第三節(jié)藥物的酶法生產(chǎn)第一節(jié)酶工程概論一、酶的特性二、酶工程的研究?jī)?nèi)容三、酶工程的研究進(jìn)展及應(yīng)用酶的定義和分類酶的定義----酶是生物體內(nèi)具有生物催化功能的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。酶的分類----分為6大類

1、氧化-還原酶

2、轉(zhuǎn)移酶

3、水解酶

4、裂合酶

5、異構(gòu)酶

6、連接酶（合成酶）酶的特性1、專一性強(qiáng)2、催化效率高3、反應(yīng)條件溫和4、酶活性的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜

醛糖還原酶的活性中心酶的來源（一）來源類別（二）利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)（三）各種能夠生產(chǎn)酶的微生物

蚯蚓含蚓激酶，對(duì)心血管疾病有較好的治療效果（一）來源類別1、酶作為生物催化劑普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物中，可以直接從生物體中分離提純而獲得，早期酶的生產(chǎn)多是以動(dòng)植物為主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前還受到試劑、設(shè)備條件的限制。3、利用動(dòng)物、植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法來生產(chǎn)酶，由于周期較長(zhǎng)、成本較高，也存在一定難度。4、利用微生物生產(chǎn)酶制劑。（二）利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)（1）能夠生產(chǎn)酶的微生物種類繁多，有較大的選擇余地。（2）微生物繁殖快、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便，培養(yǎng)過程容易控制，（3）微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠培育出新的高產(chǎn)菌株。（三）各種能夠生產(chǎn)酶的微生物1、氧化-還原酶（1）葡萄糖氧化酶 （來源于霉菌）（2）D氨基酸氧化酶 （來源于霉菌、腎臟）（3）尿激酶 （來源于酵母菌、腎臟）（4）過氧化氫酶 （來源于細(xì)菌、霉菌、紅血球）（5）近氧化物酶 （來源于植物）2、轉(zhuǎn)移酶（1）轉(zhuǎn)氨基酶 （來源于細(xì)菌、動(dòng)物肝臟）（2）核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 （來源于細(xì)菌）3、水解酶4、裂合酶5、異構(gòu)酶3、水解酶脂肪酶 （來源于細(xì)菌、霉菌、胰臟）

5`-磷酸二酯酶 （來源于霉菌）

淀粉酶 （來源于細(xì)菌、霉菌、胰臟、麥芽）

果膠酶 （來源于細(xì)菌、霉菌）

纖維素酶 （來源于霉菌、蘑菇）

半纖維素酶 （來源于霉菌）

溶菌酶 （來源于細(xì)菌、雞卵白）

蜜二糖酶 （來源于霉菌）

乳糖酶 （來源于細(xì)菌、霉菌）

轉(zhuǎn)化酶 （來源于細(xì)菌、酵母）

透明質(zhì)酸酶 （來源于細(xì)菌、動(dòng)物睪丸）

凝乳酶 （來源于霉菌、小牛胃、羊胃）

天冬酰胺酶 （來源于細(xì)菌）

脲酶 （來源于豆科植物）

青霉素?；? （來源于細(xì)菌、霉菌）

氨基?；? （來源于細(xì)菌、霉菌、牛腎臟）

橙皮苷酶 （來源于霉菌）

蛋白酶 （來源于霉菌、放線菌、動(dòng)物內(nèi)臟、植物瓜果）裂合酶和異構(gòu)酶4、裂合酶天冬氨酸-β-脫羧酶 （來源于細(xì)菌）β-酪氨酸酶 （來源于細(xì)菌）延胡索酸酶 （來源于細(xì)菌）谷氨酸脫羧酶 （來源于細(xì)菌）5、異構(gòu)酶氨基酸消旋酶 （來源于細(xì)菌、霉菌、酵母）葡萄糖異構(gòu)酶 （來源于細(xì)菌、放線菌

酶的生產(chǎn)菌種1、對(duì)生產(chǎn)菌種的要求2、目前常用的產(chǎn)酶微生物

1、對(duì)生產(chǎn)菌種的要求（1）產(chǎn)酶量高（2）不是致病菌（3）性能穩(wěn)定，不容易變異、退化、不易感染噬菌體。（4）能夠利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短、易于培養(yǎng)。2、目前常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌---用來生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素?；?、β-半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黃曲霉）---用來生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；浮⒅久??？莶輻U菌---用于生產(chǎn)a-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶。啤酒酵母---用來生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶。青霉菌---用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5`-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌---用于生產(chǎn)纖維素酶。根霉菌---用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶。鏈霉菌---用來生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶。產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件2、菌種的分離篩選3、菌種的變異誘導(dǎo)技術(shù)4、原生質(zhì)體誘導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)例子1、產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件（1）產(chǎn)酶促進(jìn)劑（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素（3）誘導(dǎo)劑和抑制劑（1）產(chǎn)酶促進(jìn)劑在酶制劑的生產(chǎn)過程中，如果添加少量的某種物質(zhì)就能增加酶的產(chǎn)量，則這類物質(zhì)就稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑多數(shù)是酶的誘導(dǎo)物、或者是表面活性劑，常用的產(chǎn)酶促進(jìn)劑有：（A）吐溫-80（B）脂肪酰胺磺酸鈉（C）聚乙烯醇（D）糖脂（E）乙二胺四乙酸（EDTA）（2）影響酶產(chǎn)量的各種因素A、溫度---各種產(chǎn)酶微生物對(duì)于溫度的要求是各不相同的。細(xì)菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值---通過掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通過添加緩沖劑、能夠控制發(fā)酵液的PH值。C、通氣量（供氧量）訖今為止，產(chǎn)酶和微生物都是需氧性的微生物。在液體深層發(fā)酵中，微生物利用的氧必須是溶解于培養(yǎng)基中和溶解氧。空氣中的氧氣---培養(yǎng)基溶解氧---透過細(xì)胞膜進(jìn)入原生質(zhì)。精確測(cè)定時(shí)采用溶氧儀。D、攪拌---攪拌可將泡沫打碎、增加氧氣的溶解速度、加強(qiáng)了液體的湍流作用，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體細(xì)胞的接觸，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝。E、泡沫E、泡沫酶制劑發(fā)酵過程中泡沫較多。泡沫的存在會(huì)阻止CO2的排除、同時(shí)直接影響O2的溶解。排除常常采用：機(jī)械力消泡沫法、化學(xué)消泡劑消泡沫法。常用的消泡劑有：天然油類、礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、磷酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷等等物質(zhì)。國(guó)內(nèi)酶制劑工業(yè)常用的消泡劑為：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敵（聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油醚）（3）誘導(dǎo)劑和抑制劑某些酶反應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)基中不存在誘導(dǎo)物質(zhì)時(shí)，其酶的合成就受到抑制，而當(dāng)添加誘導(dǎo)物質(zhì)時(shí)，酶的合成就能順利進(jìn)行，這類物質(zhì)稱作誘導(dǎo)劑。使用某些酶的抑制劑常常能夠促進(jìn)酶的合成，如在多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑S-AI，能增加淀粉酶的產(chǎn)量。在酶的生產(chǎn)中，加入適量表面活性劑，也能提高酶制劑產(chǎn)量，如用爪哇真青霉生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，如果添加0.1%的吐溫-80，則纖維素酶的產(chǎn)量可提高4倍。2、菌種的分離篩選（1）含菌樣品質(zhì)采集（2）富集培養(yǎng)（3）菌種純化

3、菌種的變異誘導(dǎo)技術(shù)（1）采用物理、化學(xué)方法進(jìn)行誘導(dǎo)物理方法----紫外線、X射線、γ-射線、高能電子、快速中子?；瘜W(xué)方法----亞硝基胍、亞硝酸。（2）采用基因工程技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)德國(guó)的生物技術(shù)人員，提取出大腸桿菌的青霉素?；富颍ㄟ^質(zhì)粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構(gòu)建的工程菌，其產(chǎn)酶能力提高了50倍。在國(guó)內(nèi)，有人將產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌基因，通過質(zhì)粒pBR233，克隆到宿主大腸桿菌中，新構(gòu)建的工程菌，其表觀活力提高了5倍。有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纖維素基因克隆到酵母菌中，一旦獲得成功，就能夠利用淀粉、纖維素為原料，以酵母菌作為載體，通過發(fā)酵來生產(chǎn)酒精。（3）采用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合育種的頻率要高于普通雜交的方法。不同種屬之間也可進(jìn)行融合。在曲霉與曲霉、青霉與青霉、鏈霉菌與鏈霉菌、芽孢桿菌與芽孢桿菌之間的融合應(yīng)用較多。4、原生質(zhì)體誘導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)例子蛋白酶產(chǎn)生菌種之間的原生質(zhì)體融合共分為7步：A、使用的親本菌株B、菌株標(biāo)記的獲得C、原生質(zhì)體的制備D、細(xì)胞的再生E、原生質(zhì)的融合F、融合子的繼代培養(yǎng)、檢驗(yàn)和生產(chǎn)性能A、使用的親本菌株二親本為：（1）枯草桿菌AS1.398（2）地衣芽孢桿菌AS1.807

二者都是野生型，對(duì)利福平和鏈霉素敏感。B、菌株標(biāo)記的獲得采用紫外線進(jìn)行誘變，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株、和抗藥性菌株，經(jīng)過十代以上傳代，形成穩(wěn)定的突變菌株。C、原生質(zhì)體的制備二親本接種入完全培養(yǎng)基，37℃搖瓶培養(yǎng)20小時(shí)

↓

離心收集菌體，懸浮于0。55mol的NaCl溶液中

↓

經(jīng)4000r/min離心15分鐘，洗滌2-3次，離心，棄去上清液

↓

菌體細(xì)胞懸浮于SMM緩沖液中

↓

加入采用SMM液配制的溶菌酶1000單位/ml，置恒溫水浴溶解細(xì)胞壁，

定時(shí)取樣鏡檢，并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

↓

待原生質(zhì)球形成之后，以4000-6000r/min離心2次，每次15分鐘，

洗滌2-3次、離心

↓

放于無菌蒸餾水中，使原生質(zhì)體膨脹

↓

適當(dāng)稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上

↓

32℃下、培養(yǎng)20小時(shí)

↓

得原生質(zhì)體D、細(xì)胞的再生取原生質(zhì)體，放入0.55mol的NaCl溶液之中

↓

適當(dāng)稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上

↓

32℃下、培養(yǎng)24小時(shí)

↓

得原生質(zhì)體再生的細(xì)胞E、原生質(zhì)的融合取等量的二親本原生質(zhì)體、加入SMM溶液混勻

↓

經(jīng)4000r/min離心25分鐘，棄上清液

↓

加入由SMM配制的、含30%的、分子量為6000的PEG2-4ml

在40℃下攪勻、保溫2-3分鐘。

↓

加入3-10倍量的SMM緩沖液

↓

取適量（0.1-0.25ml/皿）涂布到含有二種抗生素的高滲完全培養(yǎng)基上，

鏈霉素含量為2000單位/ml，

利福平含量為10單位/ml，

↓

32℃下、培養(yǎng)20-36小時(shí)

↓

得初步的原生質(zhì)體融合子F、融合子的繼代培養(yǎng)和檢驗(yàn)和生產(chǎn)性能將初步的原生質(zhì)體融合子在含有鏈霉素+利福平的平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，可以檢測(cè)出穩(wěn)定的原生質(zhì)體融合子。融合菌株的生產(chǎn)性能比親株高出30%。

第二節(jié)藥用酶的生產(chǎn)一、激肽釋放酶二、雙鏈酶三、超氧化物歧化酶四、鏈激酶五、鏈道酶六、彈性酶七、胰酶八、含糖蛋白酶九、糜胰蛋白酶十、淀粉酶十一、菠蘿蛋白酶十二、β-半乳糖苷酶十三、天門冬酰胺酶十四、尿激酶一、激肽釋放酶1、藥理功能----具有擴(kuò)張血管的功能，并能提高血管通透性，起到改善血液循環(huán)的作用。2、臨床應(yīng)用----治療動(dòng)脈硬化、血管炎、四肢皮膚潰瘍。3、生產(chǎn)方法

（1）提取法生產(chǎn)----以豬的頷下腺為原料進(jìn)行提取。

（2）提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進(jìn)行提取。二、雙鏈酶1、藥理作用----內(nèi)含二種酶，二者合用可清除炎癥物、膿塊、瘀血，促進(jìn)外傷傷愈合。

（1）為鏈激酶（SK）、又稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維部分。

（2）為鏈道酶（SD）、又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細(xì)胞2、臨床應(yīng)用----治療血腫、膿腫、骨髓炎、創(chuàng)傷性感染、潰瘍。3、生產(chǎn)方法----細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)。三、超氧化物歧化酶1、藥理作用----能專一性地清除人體內(nèi)的超氧陰離子自由基。2、臨床應(yīng)用----治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，自身免疫疾病、心肌缺血、抗衰老、斷肢再植、整形美容。3、生產(chǎn)方法

（1）提取法----從新鮮豬血中提取

（2）提取法----從玉米中提取鏈激酶和鏈道酶四：鏈激酶鏈激酶（SK）稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物的纖維部分。生產(chǎn)方法----由β-溶血性鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)五：鏈道酶鏈道酶（SD）又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細(xì)胞。發(fā)酵法生產(chǎn)----由β-溶血性鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)。

六、彈性酶1、藥理作用----能夠水解彈性蛋白、血纖維蛋白、血紅蛋白。2、臨床應(yīng)用----用于治療高血脂、慢性支氣管炎、動(dòng)脈硬化、高血壓、脂肪肝。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進(jìn)行提取。七、胰酶1、藥理作用----其成份為胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。能夠消化淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪。2、臨床應(yīng)用----助消化，增加食欲。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進(jìn)行提取。八、含糖蛋白酶1、藥理作用----是一種蛋白質(zhì)消化酶2、臨床應(yīng)用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以豬的胰臟為原料進(jìn)行提取。九、糜胰蛋白酶1、藥理作用----是一種蛋白質(zhì)消化酶2、臨床應(yīng)用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以牛羊的腸粘膜為原料進(jìn)行提取。十、淀粉酶1、藥理作用----是一種消化酶2、臨床應(yīng)用----助消化，增加食欲3、生產(chǎn)方法

發(fā)酵法生產(chǎn)----以黃曲霉發(fā)酵生產(chǎn)。

十一、菠蘿蛋白酶1、藥理作用----具有消炎、抗水腫的作用。2、臨床應(yīng)用----治療炎癥、水腫、血腫、支氣管炎、肺之、乳腺炎、靜脈炎。3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以菠蘿的皮為原料進(jìn)行提取。十二、β-半乳糖苷酶1：藥理作用----消化酶，能夠消化乳糖2：臨床應(yīng)用----適用于嬰兒乳糖消化不良。3：生產(chǎn)方法

發(fā)酵法生產(chǎn)----以毛霉（米曲酶）發(fā)酵生產(chǎn)。

十三、天門冬酰胺酶（一）藥理作用和臨床應(yīng)用1、藥理作用----對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。2、臨床應(yīng)用----抗腫瘤制劑（二）生產(chǎn)方法

（二）生產(chǎn)方法發(fā)酵法生產(chǎn)----以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。

大腸桿菌種子級(jí)菌種

↓

加入玉米漿，發(fā)酵罐、37℃下培養(yǎng)7小時(shí)

↓

取發(fā)酵液，加入丙酮后壓濾

↓

濾餅風(fēng)干，得干菌體

↓

加入硼酸緩沖液，PH=8、37℃下提取

↓

得提取液，加醋酸調(diào)節(jié)PH=4。3，

↓

得沉淀物，即為干粗酶

↓

加入甘氨酸，60℃熱處理30分鐘

↓

得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的PH值下進(jìn)行精制

↓

得無熱源酶液

↓

凍干、無菌分裝

↓

得天門冬酰胺酶凍干制劑十四、尿激酶1、藥理作用----是一種蛋白質(zhì)水解酶，具有溶血作用和降血壓作用2、臨床應(yīng)用----抗血栓3、生產(chǎn)方法

提取法生產(chǎn)----以男性新鮮尿液為原料進(jìn)行提取。第三節(jié)固定化酶工程一、酶和細(xì)胞的固定化二、固定化酶的制備技術(shù)三、固定化細(xì)胞的制備技術(shù)四、固定化生物反應(yīng)器一、酶和細(xì)胞的固定化（一）固定化酶的定義（二）固定化生物催化劑的特點(diǎn)（三）酶固定化的方法分類（四）細(xì)胞固定化的方法分類（五）固定化技術(shù)所用載體（一）固定化酶的定義固定化酶是指限制或者固定于特定空間位置的酶，具體來說，就是指經(jīng)過物理、化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失的固定化催化劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。酶可以采用經(jīng)過分離后高純度的提純酶、也可以是菌體細(xì)胞碎片上的酶系，甚至可以是死細(xì)胞上的酶。（二）固定化生物催化劑的特點(diǎn)（1）固定化酶屬于修飾酶，這種酶可以通過化學(xué)、生物、分子工程手段加以改良。（2）固定化酶的穩(wěn)定性很高，可以多次連續(xù)使用。（3）反應(yīng)以后，產(chǎn)物中不含酶，易于純化。（4）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)控制。（5）酶的利用率高，酶的實(shí)際使用量較少。（6）固定化酶比水溶性酶更適合進(jìn)行多酶反應(yīng)。（三）酶固定化的方法分類1、載體結(jié)合法2、交聯(lián)法3、包埋法

1、載體結(jié)合法（1）物理吸附法（2）離子結(jié)合法（3）共價(jià)鍵結(jié)合法

（1）物理吸附法A、物理吸附法的優(yōu)點(diǎn)：

（1）操作簡(jiǎn)單

（2）可選用不同的吸附劑

（3）酶失活之后，載體可以再生B、物理吸附法的缺點(diǎn)：

（1）酶的最適吸附量無規(guī)律可尋

（2）酶與載體之間的吸附力不強(qiáng)，酶容易脫落。C、常用的吸附劑C、常用的吸附劑活性炭

碳酸鈣----每克載體能吸附1mg酶蛋白。

纖維素

多孔玻璃

酸性白土

漂白土

高嶺石

氧化鋁

硅膠

膨潤(rùn)土

羥基磷灰石

磷酸鈣

金屬氧化物----二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒，直徑為100-200um，每克載體能吸附17mg酶蛋白。

淀粉

谷蛋白

陶瓷

丁基葡聚糖凝膠

已基葡聚糖凝膠

單寧纖維素衍生物（2）離子結(jié)合法A、離子結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)----操作簡(jiǎn)單、處理?xiàng)l件溫和，酶的活性中心不容易被破壞。B、離子結(jié)合法的缺點(diǎn)----載體和酶的結(jié)合力較弱、常常發(fā)生酶脫落的現(xiàn)象

C、常用的離子結(jié)合劑樹脂----陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、多糖類離子交換劑、合成高分子類離子交換劑。每克載體能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纖維素Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50（3）共價(jià)鍵結(jié)合法酶分子上的氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基與載體表面的反應(yīng)基團(tuán)形成共價(jià)鍵，因而將酶固定在載體上的方法。A、共價(jià)鍵結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)----酶與載體結(jié)合牢固，酶不會(huì)發(fā)生脫落。B、共價(jià)鍵結(jié)合法的缺點(diǎn)----操作復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻，酶的活性中心會(huì)遭到部分性的破壞。C、共價(jià)鍵結(jié)合法的類別重氮化 迭氮化

酸酐活化法 酰氯法

異硫氰酸酯法 縮合劑法

溴化氰活化法 烷基化法紀(jì)

硅烷基化法2、交聯(lián)法（1）交聯(lián)的優(yōu)缺點(diǎn)（2）交聯(lián)法的類別和內(nèi)容（3）參與交聯(lián)的酶蛋白功能團(tuán)和常用的交聯(lián)劑（1）交聯(lián)的優(yōu)缺點(diǎn)交聯(lián)法是采用雙功能、或者多功能試劑，使得酶與酶之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法?；鶊F(tuán)之間的交聯(lián)通過共價(jià)鍵結(jié)合。交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)----交聯(lián)后的酶活性較高交聯(lián)法的缺點(diǎn)----反應(yīng)條件劇烈、酶的回收率低。（2）交聯(lián)法的類別和內(nèi)容類別酶與酶交聯(lián)法酶與輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法內(nèi)容分子內(nèi)交聯(lián)分子間交聯(lián)酶與輔助蛋白分子之間交聯(lián)酶與載體之間交聯(lián)（3）參與交聯(lián)的酶蛋白功能團(tuán)和常用的交聯(lián)劑參與交聯(lián)的酶蛋白功能團(tuán)N-末端的α-氨基賴氨酸的ε-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基常用的交聯(lián)劑戊二醛雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸1、5-二氟-2、4-二硝基苯已二酰亞胺二甲酯3、包埋法包埋法的優(yōu)點(diǎn)----不需要改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶的回收率較高。包埋法的缺點(diǎn)----包埋酶容易導(dǎo)致酶的失活，包埋法只適用于小分子底物的反應(yīng)過程，大分子底物由于無法進(jìn)入凝膠，故不適用。包埋法分為三類

（1）凝膠包埋法

（2）微囊化包埋法

（3）纖維包埋法（1）凝膠包埋法凝膠包埋法也稱網(wǎng)格法，是指將酶包埋在高分子凝膠的細(xì)策網(wǎng)格之中。凝膠包埋法是目前因定化技術(shù)中用得最多的方法。所用的凝膠有：

聚丙烯酰胺

聚乙烯醇

光敏樹脂

淀粉

明膠

膠原

海藻膠（卡拉膠）

角叉菜膠（2）微囊化包埋法將酶包埋在高分子半透膜中的方法，稱為微囊化包埋法。微囊化固定化酶的優(yōu)點(diǎn)----微囊化固定化酶的直徑為幾微米到幾百微米之間的球狀體，其顆粒較小，有利于大分子底物進(jìn)行反應(yīng)。微囊化固定化酶的缺點(diǎn)----反應(yīng)條件要求高，制備成本也較高。（3）纖維包埋法此法適用于大規(guī)模生產(chǎn)。纖維包埋法所形成的聚合物，每克能夠包埋1500mg的轉(zhuǎn)化酶，并且具有良好的穩(wěn)定性。制備時(shí)，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纖維素、聚氯乙烯）的有機(jī)溶劑（二氯甲烷）中進(jìn)行乳化，

↓

然后將乳化液通過一多孔噴絲頭擠壓進(jìn)凝結(jié)浴池中，形成纖維

↓

酶溶液便被包裹在纖維內(nèi)

↓

將纖維編織成各種酶布，以適合反應(yīng)器的要求。（四）細(xì)胞固定化的方法分類（1）交聯(lián)法（2）包埋法（3）選擇性熱變性法----此法專用于細(xì)胞固定化，是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下處理，使其細(xì)胞膜蛋白質(zhì)變性，但不使其酶變性，從而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。

（五）固定化技術(shù)所用載體1、固定化載體必須符合的條件（1）固定化過程不傳統(tǒng)引起酶變性。（2）對(duì)酸堿具有一定的耐受性。（3）具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。（4）具有一定的親水性，并且具有良好的穩(wěn)定性。（5）具有一定的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒均勻。（6）進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合時(shí)，具有可活化基團(tuán)。（7）有耐受酶和微生物細(xì)胞的能力。（8）廉價(jià)易得。2、常用的固定化載體（1）物理吸附載體（2）離子吸附載體（3）包埋法吸附載體（4）共價(jià)鍵結(jié)合載體（1）物理吸附載體活性炭 碳酸鈣 纖維素漂白土 高嶺石 石英砂氧化鋁 硅膠 礬土膨潤(rùn)土 膠棉 羥基磷灰石磷酸鈣凝膠 淀粉 谷蛋白陶瓷 二氧化硅 皂土煤渣 多孔玻璃 酸性白土金屬氧化物（二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒）丁基葡聚糖凝膠單寧纖維素衍生物已基葡聚糖凝膠（2）離子吸附載體陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂DEAE-纖維素TEAT-纖維素羧甲基纖維素DEAE-Sephadex—A50Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50（3）包埋法吸附載體聚丙烯酰胺凝膠 三醋酸纖維素二醋酸纖維素 甲殼素硅膠 聚乙烯醇丙烯酸高取物 瓊脂瓊脂糖 光敏樹脂淀粉 明膠膠原 海藻膠卡拉膠 角叉菜膠（4）共價(jià)鍵結(jié)合載體纖維素 Sephadex——A200瓊脂 瓊脂糖苯胺多孔玻璃 對(duì)氨基苯纖維素聚丙烯酰胺 膠原尼龍 多聚氨基酸多孔玻璃珠 金屬氧化物二、固定化酶的制備技術(shù)（一）固定化酶的制備（二）固定化酶的形狀和性質(zhì)（三）固定化酶的活力測(cè)定方法

（一）固定化酶的制備1、固定化方法的選擇（1）固定化酶應(yīng)用的安全性，應(yīng)該附合藥用和食用標(biāo)準(zhǔn)。（2）固定化酶的穩(wěn)定性，能夠長(zhǎng)期反復(fù)使用。（3）固定化酶的成本、水、電、氣、設(shè)備、勞務(wù)等費(fèi)用。2、固定化酶的選擇----目前在工業(yè)化大生產(chǎn)經(jīng)常應(yīng)用的有：（1）聚乙烯醇（2）卡拉膠（3）海藻膠。3、固定化酶制備技術(shù)3、固定化酶制備技術(shù)（1）物理吸附法---將酶的水溶液與具有高度吸附能力的載體混合，然后洗去雜質(zhì)和未吸附的酶，即得固定化酶。（2）離子吸附法---將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換基混合后，洗去雜質(zhì)和未吸附的酶，即得固定化酶。（3）凝膠包埋法---將凝膠材料（卡拉膠、海藻膠、瓊脂及明膠）與水混合，加熱使之溶解，再降至其凝固點(diǎn)溫度，然后加入預(yù)保溫的酶溶液、混合均勻，最后冷卻凝固成型、即成固定化酶。（4）凝膠包埋聯(lián)合法---在進(jìn)行聚丙烯酰胺包埋時(shí)，將酶、混合單體、交聯(lián)緩沖劑一起混合，再加入催化劑，在單體產(chǎn)生聚合反應(yīng)形成凝膠的同時(shí)，將酶限制在網(wǎng)格之中，經(jīng)過破碎后就成為固定化酶。（5）脂質(zhì)體包埋法---這是一種采用表面活性劑和磷脂酰膽堿等物質(zhì)，形成液膜來包埋酶的方法。（6）纖維包埋法---即前面已經(jīng)講述的酶布包埋方法。（7）共價(jià)鍵結(jié)合法---實(shí)質(zhì)上是一種酶與包埋劑之間的化學(xué)反應(yīng)過程（8）界面沉降微囊包埋法（9）界面聚合微囊包埋法（10）交聯(lián)法（8）界面沉降微囊包埋法采用與水不相溶的、沸點(diǎn)比水低的有機(jī)相A。 ↓將酶液在有機(jī)相A中乳化、形成油包水的微滴。 ↓再在乳化液中加入溶于有機(jī)溶劑的高聚物B。 ↓再加入不能溶解高聚物B的另一種有機(jī)溶劑C。 ↓結(jié)果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶。（9）界面聚合微囊包埋法含酶的、10%的血紅蛋白溶液+已甲叉二胺水溶液------充分混合

↓

加入1%的Span-85的氯仿-環(huán)已烷進(jìn)行分散乳化，

↓

再加入溶于有機(jī)相的癸二酰氯，酶和載體在油-水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)，

↓

棄去上清液，加入Tween-20去乳化，

↓

洗去有機(jī)溶劑用未聚合的單體，

↓

將聚合物轉(zhuǎn)移到水相之中，就成微囊。

所制得的微囊直徑在1-300um之間，每1ml酶溶液可以制得2500cm2總表面積的微囊。（10）交聯(lián)法是指向酶液中加入多功能試劑，在一定的條件下使酶在分子內(nèi)、或者在分子間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終形成固定化酶的技術(shù)。交聯(lián)法可以分為：（1）酶與輔助蛋白交聯(lián)法（2）吸附交聯(lián)法（3）載體交聯(lián)法。如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=5.2-5.7、溫度為0℃的條件下，24小時(shí)即完成酶的固定化。（二）固定化酶的形狀和性質(zhì)1、固定化酶的形狀2、固定化酶的性質(zhì)3、酶穩(wěn)定性的變化1、固定化酶的形狀固定化酶的形狀----酶膜、酶管、酶纖維、微囊、顆粒狀的固定化酶。（1）顆粒狀的固定化酶----又可分為酶珠、酶塊、酶片和酶粉。其制備方法簡(jiǎn)單、顆粒比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，適用于各類反應(yīng)器。（2）纖維狀的固定化酶----只適用于填充床式反應(yīng)器。（3）膜狀的固定化酶----也稱為酶膜，其表面積大、滲透阻力小，可用于酶電極、破碎之后也可用于填充床反應(yīng)器，目前已經(jīng)用于生產(chǎn)木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、氨基?；浮㈦迕傅?。（4）管狀的固定化酶----其機(jī)械強(qiáng)度大，切短之后可用于填充床式反應(yīng)器，也可組裝成列管式反應(yīng)器。2、固定化酶的性質(zhì)（1）酶活力的變化----經(jīng)過固定化之后，酶的活力大都發(fā)生下降。（2）酶反應(yīng)特性的變化----底物專一性，酶經(jīng)過固定化之后，由于位阻效應(yīng)，其活性會(huì)下降。（3）最適PH值----酶經(jīng)過固定化之后，其最適PH值會(huì)發(fā)生變化。（4）最適溫度----酶經(jīng)過固定化之后，其空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，因此，其最適溫度也會(huì)提高。（5）米氏常數(shù)----改變不顯著。（6）最大反應(yīng)速度----會(huì)產(chǎn)生一定的差異。3、酶穩(wěn)定性的變化（1）操作穩(wěn)定性----當(dāng)固定化酶的穩(wěn)定半衰期達(dá)到1個(gè)月以上時(shí)，就具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

（2）貯藏穩(wěn)定性----固定化的胰蛋白酶在20℃保存數(shù)月，其活性不變。

（3）對(duì)熱穩(wěn)定性----由于加熱提高了反應(yīng)速度，從而提高反應(yīng)效率。

（4）對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性----大多數(shù)天然酶在經(jīng)過固定化之后，它們對(duì)于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。這在工業(yè)生產(chǎn)中是極為有利的。（三）固定化酶的活力測(cè)定方法在酶促反應(yīng)中，其底物或者產(chǎn)物具有光吸收、旋光、電位差、熒光等變化，可以使用分光光度計(jì)進(jìn)行直接測(cè)定。（1）分批測(cè)定法

固定化酶在攪拌、振蕩的情況下，每間隔一定時(shí)間取樣，過濾之后按常規(guī)方法測(cè)定。（2）連續(xù)測(cè)定法

從反應(yīng)器中引出反應(yīng)液到流動(dòng)比色杯中，在分光光度計(jì)中進(jìn)行連續(xù)測(cè)定。

或者通過測(cè)定反應(yīng)過程中氧氣、NH4、電導(dǎo)率、消化系數(shù)來確定酶的活力。酶活力測(cè)定儀器三、固定化細(xì)胞的制備技術(shù)1、固定化細(xì)胞的制備2、固定化細(xì)胞的形狀和性質(zhì)訖今為止技術(shù)上還沒有過關(guān)的原因：（1）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)存在著難題。（2）固定化之后，細(xì)胞的生物學(xué)活性存在著障礙。（3）細(xì)胞固定方法上在套用酶固定化技術(shù)，但是細(xì)胞不同于酶的單分子蛋白質(zhì)，技術(shù)共用難度很大。在此只能作為標(biāo)題介紹，不宜展開。四、固定化生物反應(yīng)器1、酶反應(yīng)器2、固定化反應(yīng)器的類型和特點(diǎn)3、固定化反應(yīng)器的選擇依據(jù)1、酶反應(yīng)器用于酶催化反應(yīng)的裝置稱為酶反應(yīng)器，它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。2、固定化反應(yīng)器的類型和特點(diǎn)（1）間歇式攪拌反應(yīng)罐（BSTR）（2）連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)罐（CSTR）（3）填充式反應(yīng)罐（PBR）（4）流化床反應(yīng)器（FBR）（5）循環(huán)反應(yīng)器（RCR）（6）連續(xù)流動(dòng)攪拌—超濾膜反應(yīng)器（CSTR/UF）（7）其它反應(yīng)器（1）間歇式攪拌反應(yīng)罐（BSTR）也稱為分批攪拌反應(yīng)器。其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便。其缺點(diǎn)是，經(jīng)過單一批次的反應(yīng)之后，酶就隨著反應(yīng)產(chǎn)物流失。主要用于游離酶反應(yīng)。當(dāng)前食品和飲料工業(yè)中常用這類反應(yīng)器。其方法是將酶和底物一起加入到反應(yīng)器中，控制反應(yīng)溫度，當(dāng)達(dá)到預(yù)期的轉(zhuǎn)化率時(shí)，隨即放料。（2）連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)罐（CSTR）這是一種連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料的反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)上與間歇式攪拌反應(yīng)器基本相同。（3）填充式反應(yīng)罐（PBR）屬于使用最普遍的反應(yīng)器。主要用于固定化酶生產(chǎn)的反應(yīng)器。固定化酶通常以各種形狀如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反應(yīng)層內(nèi)。固定化酶所使用的載體有多也玻璃珠、珠狀離子交換樹脂、聚丙烯酰胺凝膠、二乙胺乙基葡聚糖凝膠，膠原蛋白薄膜片。填充式反應(yīng)罐系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，底物按照向上流動(dòng)的方向以恒定的速度通過反應(yīng)床。（4）流化床反應(yīng)器（FBR）在流化床反應(yīng)器，底物溶液以足夠大的流速向上通過反應(yīng)床。使得固體顆粒處于流化狀態(tài)，從而來增加反應(yīng)效率。由于流化床反應(yīng)器具有混合程度高，傳熱性能良好等特點(diǎn)，因此可以用來處理粘性較強(qiáng)的底物、或者用來處理含有固體顆粒的底物。（5）循環(huán)反應(yīng)器（RCR）這種反應(yīng)器是讓部分反應(yīng)產(chǎn)物流出，流出物再與原始底物混合之后重新流入反應(yīng)系統(tǒng)的方法。循環(huán)反應(yīng)器能夠提高液體的流速，并能減少底物在固定化酶表面沉積，從而達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)反應(yīng)底物是不溶性物質(zhì)時(shí)，可以采用循環(huán)反應(yīng)器生產(chǎn)。(6)鼓泡式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器(bubblecolumnreactor,BCR)是利用從反應(yīng)器底部通入的氣體產(chǎn)生的大量氣泡，在上升過程中起到提供反應(yīng)底物和混合兩種作用的一類反應(yīng)器。也是一種無攪拌裝置的反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器可以用于游離酶和固定化酶的催化反應(yīng)。在使用鼓泡式反應(yīng)器進(jìn)行固定化酶的催化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易,剪切力小，物質(zhì)與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應(yīng)中常用的一種反應(yīng)器。例如氧化酶催化反應(yīng)需要供給氧氣，羧化酶的催化反應(yīng)需要供給二氧化碳等。(6)膜反應(yīng)器膜反應(yīng)器（membranereactor,MR）是將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器。可以用于游離酶的催化反應(yīng)，也可以用于固定化酶的催化反應(yīng)。用于固定化酶催化反應(yīng)的膜反應(yīng)器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應(yīng)器。膜反應(yīng)器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應(yīng)器。（7）連續(xù)流動(dòng)攪拌-超濾膜反應(yīng)器（CSTR/UF）連續(xù)流動(dòng)攪拌-超濾膜反應(yīng)器=連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)器+超濾膜裝置。超濾膜被安裝在連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)器的出口處，這種膜只允許反應(yīng)產(chǎn)物、或者是未曾反應(yīng)的底物通過，而分子量較大的酶就被截留在反應(yīng)器中，從而實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用。在CSTR（連續(xù)式攪拌罐）出口處設(shè)置一個(gè)超濾器。可以將小分子產(chǎn)物與大分子酶和底物分開，有利于產(chǎn)物回收。該反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。游離酶在膜反應(yīng)器中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，底物溶液連續(xù)地進(jìn)入反應(yīng)器，酶在反應(yīng)容器的溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)后，酶與反應(yīng)產(chǎn)物一起，進(jìn)入膜分離器進(jìn)行分離，小分子的產(chǎn)物透過超濾膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循環(huán)使用?；乇菊履夸洠?）其它反應(yīng)器淤漿式反應(yīng)器滴流床反應(yīng)器氣栓式流動(dòng)反應(yīng)器轉(zhuǎn)盤式反應(yīng)器篩板反應(yīng)器復(fù)合類反應(yīng)器各種酶反應(yīng)器的特點(diǎn)反應(yīng)器類型適用的操作方式適用的酶特點(diǎn)攪拌罐式反應(yīng)器分批式,流加分批式連續(xù)式,游離酶固定化酶反應(yīng)比較完全，反應(yīng)條件容易調(diào)節(jié)控制。填充床式反應(yīng)器連續(xù)式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應(yīng)的速度。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。流化床反應(yīng)器分批式流加分批式連續(xù)式固定化酶流化床反應(yīng)器具有混合均勻，傳質(zhì)和傳熱效果好，溫度和pH值的調(diào)節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對(duì)粘度較大反應(yīng)液也可進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)器類型適用的操作方式適用的酶特點(diǎn)鼓泡式反應(yīng)器分批式流加分批式連續(xù)式游離酶固定化酶鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質(zhì)、傳熱效率高,適合于有氣體參與的反應(yīng)。膜反應(yīng)器連續(xù)式游離酶固定化酶清洗比較困難噴射式反應(yīng)器連續(xù)式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實(shí)現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時(shí)催化反應(yīng)，適用于某些耐高溫酶的反應(yīng)3、固定化反應(yīng)器的選擇依據(jù)（1）根據(jù)固定化酶的形狀來選擇。（2）根據(jù)底物的物理性質(zhì)來選擇。（3）根據(jù)外界環(huán)境條件對(duì)于酶的穩(wěn)定性來選擇。（4）根據(jù)操作要求和固定化酶反應(yīng)器的投資費(fèi)用來選擇。通常顆粒狀、片狀、膜狀或纖維狀固定化酶均可采用填充床反應(yīng)器（PBR），而顆粒狀、粉末狀及片狀固定化酶均可使用于連續(xù)式攪拌罐（CSTR），膜狀固定化酶要用螺旋卷膜式反應(yīng)器。在應(yīng)用游離酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，酶與底物均溶解在反應(yīng)溶液中，通過互相作用，進(jìn)行催化反應(yīng)?？梢赃x用攪拌罐式反應(yīng)器、膜反應(yīng)器、鼓泡式反應(yīng)器、噴射式反應(yīng)器等。可溶性底物適用于所有的反應(yīng)器。難溶底物或者底物溶液呈膠體狀者，易堵塞柱床，可選用FBR。顆粒狀底物溶液可適用于CSTR。當(dāng)反應(yīng)過程需要控制溫度、調(diào)節(jié)pH時(shí)，選用CSTR更為方便。在反應(yīng)器操作過程中，由于攪拌或液流的剪切作用，常會(huì)使酶從載體上脫落下來，或者由于磨損而使粒度變細(xì)，從而影響了固定化酶的操作穩(wěn)定性。第四節(jié)酶工程應(yīng)用實(shí)例一、L-天門冬酸生產(chǎn)工藝二、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸三、固定化酶法生產(chǎn)5`-復(fù)合單核苷酸注射液四、固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸五、r-氨基丁酸的生產(chǎn)工藝六、L-多巴的生產(chǎn)工藝實(shí)例1、酶工程產(chǎn)品益生源，用于飼料添加劑例2、酶工程產(chǎn)品萬壽膠囊，用于補(bǔ)充人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)例3、生態(tài)復(fù)合酶制劑，用于改善環(huán)境例4、酶工程藥品和化妝品原料天門冬酰胺酶注射劑Elspar(AsparaginaseVials)藥品名稱天門冬酰胺酶;左旋門冬酰胺酶,愛施巴,L-天門冬酰胺酶,門冬酰胺酶英文名L-Asparaginase,ASP,L-ASP,Elspar,Asparaginase適應(yīng)癥對(duì)急性粒細(xì)胞型白血病和急性單核細(xì)胞白血病也有一定療效。對(duì)惡性淋巴瘤也有較好的療效。其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于常用藥物治療后復(fù)發(fā)的病例也有效，缺點(diǎn)是單獨(dú)應(yīng)用不僅緩解期短，而且很易產(chǎn)生耐藥性，故與其他藥物合并應(yīng)用。對(duì)機(jī)體免疫有抑制作用，因而有人用來治療皮肌炎等。用量用法可用于靜注、靜滴、肌注和鞘內(nèi)注射。一般劑量：每千克體重２０～５０００單位或每平方米體表面積１００００～１５０００單位，每周３～７次。以每日每千克體重５００～１０００單位較佳。亦可每周應(yīng)用１次，每次每千克體重２５００單位，一般以３～４周為１療程。總劑量應(yīng)根據(jù)所用藥物的純度和毒性而定。靜注以等滲鹽水２０～４０ｍｌ稀釋，靜滴以５％葡萄糖液或等滲鹽水５００ｍｌ稀釋。注重事項(xiàng)1.大腸桿菌門冬酰胺酶含有內(nèi)毒素，故可引起發(fā)熱現(xiàn)象。此外，還常有食欲減退、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)，有的病人有頭痛、頭昏、嗜睡、精神錯(cuò)亂等。由于門冬酰胺酶能影響蛋白質(zhì)的合成和干擾脂質(zhì)代謝，有的病人有血漿蛋白低下，血脂質(zhì)過高或過低，氮質(zhì)血癥和肝功能損害。約１／３～１／２病人有骨髓抑制，表現(xiàn)為白細(xì)胞和血小板下降，有的病人可有貧血、凝血障礙、局部出血、感染等。有人報(bào)告有的病人有心血管系統(tǒng)癥狀、脫發(fā)、蛋白尿等，極少數(shù)病人且可發(fā)生胰腺炎。2.可引起過敏反應(yīng)，故用藥前必須先用過敏試驗(yàn)，如有紅腫、斑塊，則為過敏反應(yīng)。有過敏史的病人應(yīng)十分小心或不用。3.不同藥廠、不同批號(hào)的產(chǎn)品，其純度和過敏反應(yīng)均有差異，使用時(shí)必須慎重。4.有致畸胎作用，故妊娠早期應(yīng)禁用。5.肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p害者忌用。6.溶解后不宜長(zhǎng)時(shí)間放置，以免喪失活力。藥品規(guī)格注射用門冬酰胺酶：每支含１０００單位、２０００單位。例5、膜反應(yīng)器，用于污水處理第五節(jié)酶工程研究進(jìn)展一、酶的化學(xué)修飾二、酶的人工模擬三、有機(jī)相中的酶反應(yīng)四、基因工程酶的構(gòu)建（略）一、酶的化學(xué)修飾1、關(guān)于酶的化學(xué)修飾2、常用的化學(xué)修飾劑3、化學(xué)修飾方法4、修飾酶所具有的新特征

1、關(guān)于酶的化學(xué)修飾（1）原因----但是由于酶是一種蛋白質(zhì)，常常在應(yīng)用過程中出現(xiàn)異體蛋白的抗原性、容易被水解、容易受抑制、在反應(yīng)系統(tǒng)中半衰期較短等缺點(diǎn)。因此提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性就成為技術(shù)關(guān)鍵。（2）定義----酶的化學(xué)修飾就是在分子水平上，采用化學(xué)方法對(duì)酶進(jìn)行改造，通過添加一些化學(xué)基團(tuán)，或者采用具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)鍵聯(lián)接，從而改變酶分子性質(zhì)的一種技術(shù)。2、常用的化學(xué)修飾劑化學(xué)修飾劑的要求----具有較大的分子量，具有良好的生物相容性、具有水溶性，分子表面具有較多的反應(yīng)基團(tuán)。（1）糖以及糖的衍生物----右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖。（2）高分子多聚物----聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚N-乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）。（3）生物大分子----肝素、血漿蛋白質(zhì)、聚氨基酸。（4）雙功能試劑----戊二醛、二異硫氰酸、二胺類。（5）其它試劑----糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑。3、化學(xué)修飾方法（1）修飾酶的功能基團(tuán)----如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基。來提高穩(wěn)定性。（2）在酶分子內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)、或者進(jìn)行分子間的交聯(lián)----提高酶解能力、消除抗原性。（3）修飾酶的輔助因子----提高穩(wěn)定性。（4）使酶與高分子化合物相結(jié)合----提高穩(wěn)定性。4、修飾酶所具有的新特征（1）對(duì)熱的穩(wěn)定性有所提高。（2）具有對(duì)抗各類失活因子的能力。（3）抗原性消除。（4）體內(nèi)的半衰期有所延長(zhǎng)。（5）最適PH值發(fā)生改變。（6）酶反應(yīng)特性發(fā)生變化。（7）在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。二、酶的人工模擬根據(jù)酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有活性中心和催化反應(yīng)作用的、非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物，稱為人工模擬酶。人工模擬酶的構(gòu)成條件：（1）具有能夠識(shí)別底物的分子結(jié)構(gòu)，（2）具有酶活性部位的催化基團(tuán)。1、環(huán)糊精2、分子印跡技術(shù)1、環(huán)糊精它具有一個(gè)疏水的結(jié)合部位，能與有機(jī)分子形成包絡(luò)物，同時(shí)，它還能催化一些反應(yīng)。環(huán)糊精分子是一個(gè)椅子狀的空穴結(jié)構(gòu)，空穴的邊緣是一些葡萄糖羥基，使得環(huán)湖精能夠溶液于水?？昭ǖ闹虚g則是疏水結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⒂袡C(jī)小分子束縛到空穴之中。環(huán)糊精的酶促反應(yīng)過程為---參與反應(yīng)的底物先被環(huán)糊精分子包束，然后再發(fā)生酶促反應(yīng)。環(huán)糊精所模擬的胰凝乳蛋白酶，其催化效率與天然的胰凝乳蛋白酶相同。但是，環(huán)糊精的對(duì)熱穩(wěn)定性、對(duì)PH值穩(wěn)定性則大大高于天然的胰凝乳蛋白酶。2、分子印跡技術(shù)分子印跡技術(shù)是制備針對(duì)某一特定分子具有特異性結(jié)合能力的聚合物的過程。其實(shí)質(zhì)已經(jīng)接近于基因芯片技術(shù)

（1）分子印跡技術(shù)的過程（2）分子印跡技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值（1）分子印跡技術(shù)的過程（1）特定分子+特異性結(jié)合的功能單體，發(fā)生互補(bǔ)性結(jié)合作用，形成特定分子----功能單體復(fù)合物。（