28.3HLA分型技術(shù)講解

器官移植及免疫學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)1.掌握：

移植抗原的種類、HLA分型的方法（重難點(diǎn)）；預(yù)防移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)檢測（重難點(diǎn)）。2.熟悉：器官移植的概念和種類、移植排斥反應(yīng)的分類（難點(diǎn)）；移植后的免疫學(xué)檢測。3.了解：移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。知識目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)學(xué)會(huì)常用的HLA分型及交叉配型的方法。責(zé)任心、質(zhì)控及生物安全意識、臨床思維一器官移植概述三HLA分型技術(shù)四預(yù)防移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)措施五移植后的免疫監(jiān)測六器官移植面臨的主要問題和解決方案設(shè)想二移植排斥反應(yīng)血清學(xué)分型細(xì)胞學(xué)分型基因分型

三HLA分型技術(shù)SD抗原

HLA-ABCHLA-DRDQ補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)試驗(yàn)一、HLA血清學(xué)分型技術(shù)

將待檢淋巴細(xì)胞與一系列已知抗HLA標(biāo)準(zhǔn)分型血清混合后，抗體會(huì)特異性結(jié)合表達(dá)相應(yīng)HLA抗原的淋巴細(xì)胞，在補(bǔ)體的作用下，引起細(xì)胞死亡，死亡的細(xì)胞可被臺盼藍(lán)等染料染色，而活細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整不著色，根據(jù)死亡細(xì)胞的百分比，判定其HLA的型別。1.CDC試驗(yàn)原理2.流式細(xì)胞儀分析技術(shù)LD抗原

HLA-D和DP

混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)二、HLA細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)

兩個(gè)基因型不同個(gè)體的淋巴細(xì)胞，在體外進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，由于彼此的HLA不同，能相互刺激導(dǎo)致雙方淋巴細(xì)胞活化增殖和分化，進(jìn)而表現(xiàn)形態(tài)學(xué)的變化和細(xì)胞的增殖，可通過形態(tài)學(xué)或3H-TdR滲入試驗(yàn)來檢測淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度，從而判定其HLA型別。

單向MLC和雙向MLCMLC原理1.RFLP:限制性片段長度多態(tài)性分析2.PCR-SSOP：序列特異性寡核苷酸探針-PCR3.PCR-SSP：序列特異性引物-PCR4.PCR-SSCP：單鏈構(gòu)象特異性-PCR5.SBT分型法：基于序列的HLA分型法6.多熒光微珠免疫分析7.基因芯片三、HLA基因分型技術(shù)

不同個(gè)體間的HLA復(fù)合體存在核苷酸堿基序列的差異，這種差異造成限制性內(nèi)切酶識別位置及酶切位點(diǎn)數(shù)目的不同，用一組限制性內(nèi)切酶消化、識別、切割這些位點(diǎn)，產(chǎn)生數(shù)量和長度不一的DNA酶解片段，經(jīng)瓊脂糖電泳或用特異性探針與酶解片段進(jìn)行雜交即可確定HLA的基因型別。也可先對DNA片段進(jìn)行體外PCR擴(kuò)增，然后再進(jìn)行RFLP分析，即PCR-RFLP。1.PCR-RFLP

先對HLA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)移至NC膜或尼龍膜上，然后與用放射性核素或酶、地高辛等標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，若待檢DNA與探針序列互補(bǔ)，則兩者結(jié)合，從而確定HLA的基因型別。2.PCR-SSOP

根據(jù)各型別HLA核苷酸堿基序列差異，設(shè)計(jì)出一套HLA等位基因的序列特異性引物，對待測DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因TaqDNA聚合酶沒有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′端最后一個(gè)堿基是否與模板配對決定著能否擴(kuò)增出產(chǎn)物。若將引物的3′端最后一個(gè)堿基設(shè)計(jì)在正好有差異的那個(gè)堿基序列上，則擴(kuò)增產(chǎn)物僅需常規(guī)瓊脂糖電泳，根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對HLA進(jìn)行分型。3.PCR-SSP

用PCR擴(kuò)增特定的靶序列,經(jīng)變性使之成為兩條單鏈,然后在無變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。單鏈DNA如果存在堿基差異,即使一個(gè)堿基的不同,也會(huì)表現(xiàn)出電泳遷移率的不同,據(jù)此可將不同型別的HLA區(qū)分開,達(dá)到分型的目的。4.PCR-SSCP

首先用PCR擴(kuò)增HLA的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序，將此序列與HLA基因庫的DNA已知序列進(jìn)行比較，即可獲得HLA的基因型別。最可靠也最徹底的基因分型方法。5.SBT分型法

用標(biāo)記有生物素的特異性引物分別擴(kuò)增HLA-A、B、DR等基因座位的特異性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與已知的寡核苷酸探針（事先包被在不同顏色的磁珠上）進(jìn)行雜交，洗脫沒有結(jié)合的DNA片段，再與熒光素標(biāo)記的親和素結(jié)合，多熒光微珠在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行結(jié)果判讀，若擴(kuò)增的DNA片段能與探針結(jié)合則發(fā)熒光，不結(jié)合則無熒光。6.多熒光微珠免疫分析

首先用PCR擴(kuò)增獲得HLA的DNA片段，用放射性核素或熒光素標(biāo)記擴(kuò)增的DNA分子，再與預(yù)先點(diǎn)