生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告-坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制備及生物絮團(tuán)

坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的制備和神經(jīng)干動(dòng)作電位的觀察與傳導(dǎo)速度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)蛙類動(dòng)物雙毀髓的實(shí)驗(yàn)方法。2.學(xué)習(xí)并掌握坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制備方法。3.觀察蛙坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的基本波形，并了解其產(chǎn)生的原理。4.學(xué)習(xí)蛙和蟾蜍離體神經(jīng)干上神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)速度的方法和原理。實(shí)驗(yàn)材料：1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：蟾蜍2.實(shí)驗(yàn)器材：常規(guī)手術(shù)器械（粗剪刀、手術(shù)剪、眼科剪、手術(shù)鑷、眼科鑷）蛙板、蛙釘、探針、鋅銅弓、玻璃分針、培養(yǎng)皿、任氏液、滴管、手術(shù)線、PC機(jī)、信號(hào)采集處理系統(tǒng)、神經(jīng)屏蔽盒等。實(shí)驗(yàn)原理：神經(jīng)干在受到有效刺激以后可以產(chǎn)生復(fù)合動(dòng)作電位，標(biāo)志著神經(jīng)發(fā)生興奮。如果在離體神經(jīng)干的一段施加刺激，從另一端引導(dǎo)傳來(lái)的神興奮沖動(dòng)，可以記錄出雙相電位，加入在引導(dǎo)的兩個(gè)電極之間將神經(jīng)干麻醉或損傷，阻斷其興奮傳導(dǎo)能力，這時(shí)候記錄出的動(dòng)作電位就成為單相電位。神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位是以全或無(wú)的方式產(chǎn)生的。但是，復(fù)合動(dòng)作電位的幅值在一定刺激強(qiáng)度下是隨刺激強(qiáng)度的增加而增大的。如果在遠(yuǎn)離刺激點(diǎn)的不同距離處分別引導(dǎo)離體神經(jīng)干動(dòng)作電位，兩引導(dǎo)點(diǎn)之間的距離為m，在兩引導(dǎo)點(diǎn)分別引導(dǎo)出的動(dòng)作電位的時(shí)相差為s。即可按照公式v=m/s來(lái)計(jì)算出興奮的傳導(dǎo)速度。蛙類的坐骨神經(jīng)干屬于混合性神經(jīng)，其中包含有粗細(xì)不等的各種纖維，其直徑一般為3-29um,其中直徑最粗的有髓纖維為A類纖維，傳導(dǎo)速度在正常室溫下為35-40m/s。神經(jīng)每興奮一次極其在興奮以后的回復(fù)過(guò)程中，其興奮性都要經(jīng)歷一次周期性的變化，其全過(guò)程依次包括絕對(duì)不應(yīng)期、相對(duì)不應(yīng)期、超常期和低常期4個(gè)時(shí)期。為了測(cè)定坐骨神經(jīng)在發(fā)生一次興奮以后興奮性所發(fā)生的周期性變化，首先要給神經(jīng)施加一個(gè)條件性刺激引起神經(jīng)興奮，然后在前一興奮及其恢復(fù)過(guò)程不同時(shí)相再施加一個(gè)測(cè)試性刺激，用于檢查神經(jīng)的興奮閾值和所引起的動(dòng)作電位的幅度，以判定神經(jīng)興奮性的變化。四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟：1、坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備（1）破壞腦與脊髓：取蛙一只，用自來(lái)水沖洗干凈，左手持蛙，用食指下壓其吻部，拇指按壓在其骶髂關(guān)節(jié)下方，使其頭盡量前俯，右手持探針沿兩眼之間中線向后方輕劃，至觸及頭頸部正中的凹陷處，即為枕骨大孔的位置。用探針在凹陷處垂直刺入枕骨大孔，再將其針尖轉(zhuǎn)向前刺入顱腔，左右攪動(dòng)探針，徹底搗毀腦組織；然后緩慢地把探針退至枕骨大孔處，將其轉(zhuǎn)向后方，與脊柱平行捻動(dòng)探針使其刺入整個(gè)椎管，徹底搗毀脊髓。徹底搗毀脊髓時(shí)，可看到動(dòng)物后肢突然蹬直，然后癱軟。（2）剪去軀干上部及內(nèi)臟在骶髂關(guān)節(jié)前1cm處用金冠剪（粗剪）剪斷脊柱（可在下肢前端）。沿脊柱切口向下剪開兩側(cè)腹部皮膚至恥骨處，將頭、前肢、內(nèi)臟及腹部軟組織全部剪掉，放于污物盤，只保留下端脊柱和下肢。在腹側(cè)脊柱兩旁可看到腰骶神經(jīng)叢。注意切勿觸及或損傷坐骨神經(jīng)。剝后肢皮膚左手持鑷子夾住脊髓斷端，右手捏住斷端邊緣，剝掉全部后肢皮膚。注意不要握住或接觸坐骨神經(jīng)。將全部皮膚剝除后，把標(biāo)本置于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。將手和手術(shù)器械洗凈，以免皮膚分泌物、血液污染神經(jīng)標(biāo)本。分離兩腿在任氏液里把標(biāo)本上的血跡沖洗干凈，用鑷子從背位夾住脊柱將標(biāo)本提起，剪去向上突出的骶骨（避開坐骨神經(jīng)），然后沿正中線用粗剪刀將脊柱分為兩半，再?gòu)膼u骨聯(lián)合中央剪開兩后肢。將已分離的標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。制備坐骨神經(jīng)標(biāo)本取出一側(cè)下肢，用蛙釘固定于蛙板上，固定時(shí)要注意使坐骨神經(jīng)和腓腸肌朝上。先用玻璃分針沿脊柱側(cè)游離坐骨神經(jīng)，神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離的長(zhǎng)一些。要求上自脊髓附近的主干，下沿腓總神經(jīng)或脛神經(jīng)一直分離至踝關(guān)節(jié)附近止。坐骨神經(jīng)在膝關(guān)節(jié)后分為脛神經(jīng)和腓神經(jīng)兩支，如要制備腓神經(jīng)，則在分叉的下端將脛神經(jīng)剪斷，膝關(guān)節(jié)附近的腓神經(jīng)表面有肌肉和筋膜覆蓋，仔細(xì)分離并沿腓腸肌溝一直下行分離至跟踺，然后將棉線用任氏液浸泡后，在脊髓側(cè)坐骨神經(jīng)起始處和跟腱處將神經(jīng)結(jié)扎，在結(jié)扎的外側(cè)將神經(jīng)干剪斷，制成坐骨神經(jīng)-腓神經(jīng)標(biāo)本。另外，也可保留脛神經(jīng)而將腓神經(jīng)剪斷，制成坐骨神經(jīng)-脛神經(jīng)標(biāo)本。將制備好的神經(jīng)干標(biāo)本浸于任氏液中數(shù)分鐘，待其興奮性穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。注意在分離過(guò)程中，應(yīng)把神經(jīng)周圍的結(jié)締組織去除干凈，并把神經(jīng)的細(xì)小分支剪斷，但要注意不要用金屬器械碰觸神經(jīng)，也不要對(duì)神經(jīng)過(guò)度牽拉。實(shí)驗(yàn)期間應(yīng)不斷滴加任氏液使神經(jīng)保持濕潤(rùn)。制備好的標(biāo)本應(yīng)如下：圖1坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本示意圖神經(jīng)干動(dòng)作電位的觀察（1）連接實(shí)驗(yàn)裝置：將刺激電極連接刺激輸出，記錄電極連接到1通道和2通道，注意避免接觸不良或連接錯(cuò)誤，注意地線的連接。（2）將神經(jīng)標(biāo)本置于神經(jīng)屏蔽盒的電極上將神經(jīng)的近中樞端置于刺激電極上，外周端置于記錄電極上。（3）進(jìn)入生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論：神經(jīng)干動(dòng)作電位：所測(cè)得蟾蜍坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位圖如下，神經(jīng)干受刺激后，記錄的動(dòng)作電位即為雙相動(dòng)作電位。圖1蟾蜍神經(jīng)干復(fù)合電位神經(jīng)干動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)通道同時(shí)記錄由兩對(duì)引導(dǎo)電極記錄下的動(dòng)作電位來(lái)計(jì)算動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度。先分別測(cè)量從刺激偽跡到兩個(gè)動(dòng)作電位起始點(diǎn)的時(shí)間，設(shè)上線為t1，下線為t2，求出t2-t1的時(shí)間差值。然后再測(cè)量標(biāo)本屏蔽盒中兩對(duì)引導(dǎo)電極起始電極之間的距離d，則神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)速度V＝d/(t2-t1)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們測(cè)得t1=1.9ms，t2=2.2ms，d=1cm，V＝33.33m/s。相比標(biāo)準(zhǔn)值（35-40）來(lái)說(shuō)偏低，可能因?yàn)樯窠?jīng)纖維放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不夠濕潤(rùn)而使傳導(dǎo)速度下降。六、注意事項(xiàng)：1、在制備標(biāo)本時(shí)，避免過(guò)度牽拉神經(jīng)，不可用手或金屬器械觸碰神經(jīng)干。2、避免動(dòng)物皮膚分泌物（蟾酥、血液等）污染神經(jīng)和肌肉，也不要用水沖洗，以免影響組織機(jī)能。3、制備標(biāo)本時(shí)，要隨時(shí)用任氏液潤(rùn)濕神經(jīng)和肌肉，防止干燥。4、分離神經(jīng)時(shí)，一定要把周圍結(jié)締組織剝離干凈。5、實(shí)驗(yàn)要迅速，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響標(biāo)本活性（興奮性）。生物絮團(tuán)生物絮團(tuán)技術(shù)是指通過(guò)調(diào)控水體營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，利用多種糖類調(diào)節(jié)C/N比，配合益生菌，在最短時(shí)間內(nèi)使益生菌占優(yōu)勢(shì)，從而抑制有害菌。益生菌通過(guò)降解轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖系統(tǒng)中的殘餌、糞便等營(yíng)養(yǎng)廢物為可供浮游藻類繁殖利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到變相肥水的目的。通過(guò)轉(zhuǎn)化氮、磷等養(yǎng)殖自身污染物質(zhì)成為菌體蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種胞外產(chǎn)物和代謝物，為對(duì)蝦提供可以重新攝取的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，使養(yǎng)殖對(duì)蝦對(duì)飼料氮素利用率提高接近1倍，同時(shí)還降低了氨氮和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，凈化了水體，解決了養(yǎng)殖水體有害物質(zhì)積累的問(wèn)題。可在養(yǎng)殖系統(tǒng)中構(gòu)建良好的池塘生態(tài)，進(jìn)而使生態(tài)營(yíng)養(yǎng)循環(huán)得以形成并有效運(yùn)轉(zhuǎn)，達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定平衡的養(yǎng)殖環(huán)境。在這樣的良好養(yǎng)殖環(huán)境下，菌體蛋白質(zhì)、各種胞外產(chǎn)物和代謝物與浮游動(dòng)植物、營(yíng)養(yǎng)鹽、有機(jī)碎屑以及一些無(wú)機(jī)物質(zhì)經(jīng)生物絮凝形成團(tuán)聚物即為生物絮團(tuán)。前期菌體本身和生物絮團(tuán)共同為蝦苗提供最優(yōu)質(zhì)的天然餌料，可直接供蝦食用，降低餌料系數(shù)，提高免疫力，并調(diào)控凈化水質(zhì)。簡(jiǎn)單的說(shuō)生物絮團(tuán)有兩個(gè)重要的功能，第一是生物絮團(tuán)作為食物鏈的前端存在，為蝦苗提供最優(yōu)質(zhì)的天然餌料，從而減少餌料浪費(fèi)，降低餌料系數(shù)，提高養(yǎng)殖對(duì)蝦的消化和免疫能力，抑制致病微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本。第二是生物絮團(tuán)作為生物鏈的末端存在，可降解轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖系統(tǒng)殘餌和糞便，降低池塘富營(yíng)養(yǎng)化，促進(jìn)氮吸收，加強(qiáng)水質(zhì)穩(wěn)定性，凈化水質(zhì)；實(shí)質(zhì)上，生物絮團(tuán)是一個(gè)由菌體蛋白質(zhì)、有益菌胞外產(chǎn)物和代謝物及浮游動(dòng)植物、營(yíng)養(yǎng)鹽、有機(jī)碎屑和一些無(wú)機(jī)物質(zhì)聚集而成的小型生態(tài)圈。菌體本身和絮團(tuán)共同供蝦攝食，并調(diào)控凈化水質(zhì)。絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)素中添加的多種糖類經(jīng)科學(xué)的C/N