PAR-4拮抗劑、GIRK12激活劑和MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)、合成與活性評(píng)價(jià)

PAR-4拮抗劑、GIRK1/2激活劑和MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)、合成與活性評(píng)價(jià)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是細(xì)胞表面最大的受體家族，其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和藥物開發(fā)中占據(jù)著核心的位置。在所有現(xiàn)代藥物中，有40%以上是以G蛋白偶聯(lián)受體為靶標(biāo)，其中著名的藥物包括奧氮平、氯雷他定、雷尼替丁、替加色羅等。蛋白酶激活受體（PARs）是細(xì)胞表面的一種GPCR，是GPCRs超家族成員之一。人類血小板表達(dá)PAR-1和PAR-4兩種凝血酶受體，是抗血栓藥物的靶標(biāo)之一。在2014年5月，PAR-1小分子拮抗劑Vorapaxar（ZontivityTM）被FDA批準(zhǔn)可用于預(yù)防血栓形成，它是目前唯一一個(gè)通過抑制凝血酶受體活性來治療血栓癥的藥物；然而，以PAR-1受體為靶標(biāo)的抗血栓藥物常常導(dǎo)致流血事故發(fā)生，因此Zontivity不能用于腦出血患者。PAR-4拮抗被證明不會(huì)導(dǎo)致流血事故，因此PAR-4小分子拮抗劑被認(rèn)為是安全有效的抗血栓藥物。目前，除了YD-3之外，沒有其他類型的PAR-4小分子拮抗劑被報(bào)道。G蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀通道（GIRKs）是一類通過GPCRs來調(diào)控鉀離子通道開放和關(guān)閉的內(nèi)向整流鉀通道。GIRK1/2廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是大腦中的主要GIRK通道類型，而GIRK1/4是GIRK家族在心臟的主要存在形式。GIRKs通道激活在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要功能，與神經(jīng)細(xì)胞興奮性變化、疼痛感知、藥物上癮、癲癇癥、唐氏綜合癥、帕金森癥等密切相關(guān)。目前已知的GIRK激活劑包括醇類（例如乙醇）、麻醉劑halothane、天然產(chǎn)物naringen和fluxetine類化合物以及最近報(bào)道的ML297；但是除了ML297以外，這些激活劑的GIRK活性低且都沒有GIRK亞型選擇性。人類感覺神經(jīng)元特異性G蛋白偶聯(lián)受體MrgXs表達(dá)于人的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和三叉神經(jīng)節(jié)（TG）的小直徑傷害感覺神經(jīng)元上，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或其他組織器官中不表達(dá)或低表達(dá)。因此，MrgXs被認(rèn)為是治療疼痛的潛在有效靶標(biāo)，基于MrgXs受體的鎮(zhèn)痛藥將不會(huì)有目前以阿片受體和前列腺素為靶標(biāo)的鎮(zhèn)痛藥物所導(dǎo)致的副作用例如藥物成癮、惡心嘔吐、肌肉疼痛、腹瀉、便秘等。人類有4種MrgX受體，其中MrgX1和MrgX2被認(rèn)為是參與疼痛調(diào)制的兩種主要MrgX受體。然而，至今為止沒有任何關(guān)于MrgX1受體的正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑報(bào)道?；谝陨螾AR-4拮抗劑、GIRK1/2激活劑和MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研究現(xiàn)狀，本論文通過大量的化學(xué)優(yōu)化和高通量活性篩選以及構(gòu)效關(guān)系研究，最終獲得了新型的高活性高選擇的PAR-4拮抗劑、GIRK1/2激活劑以及MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑。主要研究結(jié)果如下：1.高活性高選擇性PAR-4拮抗劑的研究?；?-(1-芐基-1H-吲哚-3-基)苯甲酸乙酯2.2的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，從VanderbiltUniversity的小分子化合物庫中篩選出160多個(gè)與其結(jié)構(gòu)類似的化合物。通過對(duì)這些類似物的高通量活性篩選，最終發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具備新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的選擇性高活性的PAR-4拮抗劑ML354（VU0099704），對(duì)PAR-4受體的IC50為140nM，對(duì)PAR-1受體的IC50約為10μM。該小分子化合物是繼2000年被發(fā)現(xiàn)的吲哚唑化合物YD-3之后，國際上第二類PAR-4小分子拮抗劑。但體外藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明ML354的代謝穩(wěn)定性差，無法用于活體研究。因此以ML354為先導(dǎo)化合物，應(yīng)用迭代平行合成策略，合成了11個(gè)化合物庫，共計(jì)182個(gè)化合物，從中篩選出新型高選擇性高活性PAR-4拮抗劑2.551（PAR-4IC50為823nM，PAR-1IC50約為10μM）、2.552（PAR-4IC50為359nM，PAR-1IC50大于10μM）和2.63a2（PAR-4IC50為493nM，PAR-1IC50大于10μM）。構(gòu)效關(guān)系研究表明吲哚核的C-5吸電子基團(tuán)、C-2甲羥基以及C-3氫鍵受體官能團(tuán)是決定化合物PAR-4活性的關(guān)鍵藥效團(tuán)。高通量篩選所獲得的ML354以及基于ML354所獲得的三個(gè)高選擇性高活性PAR-4拮抗劑可用于PAR-4受體拮抗治療血栓癥的臨床前研究，特別是Tier1invitro研究階段；同時(shí)它們也為進(jìn)一步開發(fā)PAR-4小分子拮抗劑提供了一種新穎骨架。2.高活性高選擇性GIRK1/2激活劑的研究。以2013年發(fā)現(xiàn)的國際上第一個(gè)GIRK1/2選擇性激活劑ML297為先導(dǎo)化合物，應(yīng)用迭代平行合成策略，合成了11個(gè)化合物庫，共計(jì)172個(gè)化合物?；钚栽u(píng)價(jià)確定了N-Bn和化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的N-CF3是取代ML297的N-Ph的兩個(gè)有效官能團(tuán)，首次發(fā)現(xiàn)在吡唑核的C-3位存在調(diào)節(jié)化合物GIRK藥理模式（GIRK激活或GIRK抑制）的“分子開關(guān)”，并獲得了一種新穎的激活因子C-3環(huán)丙基。通過結(jié)合ML297的激活因子C-3甲基和新發(fā)現(xiàn)的C-3環(huán)丙基，最終篩選出高選擇性高活性的GIRK1/2激活劑3.19.1、3.19.2、3.19.4和3.19.20以及納摩爾水平的GIRK1/2和GIRK1/4雙抑制劑3.13.9、3.17.11和選擇性GIRK1/4抑制劑3.17.6和3.17.7。同時(shí)，在C-3環(huán)丙基上發(fā)現(xiàn)了一種新穎的“分子開關(guān)”，當(dāng)甲基在3-環(huán)丙基的C-2位時(shí)GIRK激活模式被開啟，而在C-1位時(shí)化合物啟動(dòng)GIRK抑制模式。這一新穎分子開關(guān)的發(fā)現(xiàn)為研發(fā)GIRK1/2和GIRK1/4激活劑或抑制劑指明了化學(xué)研究方向，有助于高效率地獲得GIRK工具化合物。氟原子經(jīng)常被添加到生物活性化合物中來提高活性、代謝穩(wěn)定性、生物可用性、靶標(biāo)蛋白選擇性等，在環(huán)丙基C-2位引入兩個(gè)氟原子出乎意料地獲得了高活性的GIRK1/2和GIRK1/4雙抑制劑3.23.8，它是研究GIRK1/4亞型通道抑制在心率失常例如心房纖顫（房顫）中的治療功能的有效工具化合物。用在化合物庫3.3中確認(rèn)的N-Bn和N-CF3取代最優(yōu)化合物系列3.19的N-Ph，如期獲得了高活性高選擇性的GIRK1/2激活劑3.27.2、3.27.3、3.27.12、3.29.2和3.29.3。上述新型GIRK1/2激活劑的選擇性和（或）激活活性優(yōu)于先導(dǎo)化合物ML297，是治療癲癇、唐氏綜合癥、帕金森癥等的有效工具化合物。3.國際上第一個(gè)高活性高選擇性MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研究。首先通過對(duì)NIH的至少300,000個(gè)小分子化合物庫進(jìn)行高通量活性篩選獲得了4個(gè)高活性高選擇性的磺酰胺取代的苯酰胺類MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑SID4258711、SID4262381、SID3665540和SID3607659，其中SID4258711活性最高。隨后，以SID4258711為先導(dǎo)化合物，應(yīng)用迭代平行合成的化學(xué)優(yōu)化策略，合成40個(gè)化合物，從中篩選出國際上第一個(gè)高活性高選擇性的MrgX1正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑ML382（即化合物4.431），對(duì)MrgX1的EC50為190nM。體外藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明ML382對(duì)氧化代謝不穩(wěn)定，在大鼠和人中的肝臟清除率估值分別為65.7mLmin-1kg-1和15.7mLmin-1kg-1。